中国当代儿科杂志  2016, Vol. 18 Issue (5): 435-439   PDF    
炎症诱导早产小鼠脑组织长链非编码RNA的筛选及验证研究
陈茹娟, 奚莎, 王凡, 肖谧, 林晓洁, 刘俐     
西安交通大学附属第一医院新生儿科, 陕西 西安 710061
摘要: 目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)与炎症诱导早产小鼠脑损伤的关系,为脑损伤的防治提供依据。方法 孕鼠腹腔注射LPS建立炎症诱导早产小鼠脑损伤模型(早产组),正常孕鼠分娩足月小鼠作为对照(足月组)。应用lncRNA芯片技术筛选与早产小鼠脑损伤相关的lncRNA,并应用Real-timePCR技术对lncRNA进行验证。结果 比较早产组与足月组,显著差异表达的lncRNA有1978条(P<0.05),包括上调lncRNA786条,下调lncRNA1192条,其中差异表达1.5倍及以上的lncRNA共有29条。对差异表达倍数最高的前10条lncRNA行进一步分析,发现这些lncRNA可能参与转录、信号转导、凋亡、细胞周期、炎症反应等生物学过程,并与G蛋白偶联受体信号通路、神经肽信号通路有关。对其中2条lncRNA在早产组和足月组脑组织中的表达进行Real-timePCR验证,发现与芯片结果一致。结论 炎症诱导早产小鼠脑组织中的lncRNA表达谱发生了明显变化,G蛋白偶联受体信号通路可能参与早产脑损伤的发生机制。
关键词: 长链非编码RNA     炎症     G蛋白偶联受体     小鼠    
Screening and validation of long non-coding RNAs in brain tissue of inflammationinduced preterm mice
CHEN Ru-Juan, XI Sha, WANG Fan, XIAO Mi, LIN Xiao-Jie, LIU Li     
Department of Neonatology, First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710061, China
Abstract: Objective To investigate the association between long non-coding RNAs (lncRNAs) and brain injury in inflammation-induced preterm mice, and to provide a reference for the prevention and treatment of brain injury. Methods An intraperitoneal injection of lipopolysaccharide in pregnant mice was performed to establish a model of inflammation-induced preterm mice with brain injury (preterm group). The full-term mice delivered by normal pregnant mice were used as controls (full-term group). The lncRNA chip assay was used to screen out the lncRNAs associated with brain injury in preterm mice. Quantitative real-time PCR was used to validate the lncRNAs identified by the above method. Results The preterm and full-term groups showed significant differences in the expression of 1 978 lncRNAs (P<0.05), consisting of 786 up-regulated lncRNAs and 1 192 down-regulated lncRNAs, and 29 lncRNAs were 1.5 or more times differentially expressed between the two groups. A further analysis was performed for the 10 most differentially expressed lncRNAs, and the results showed that these lncRNAs were involved in the biological processes including transcription, signal transduction, apoptosis, cell cycle, and inflammatory response, as well as G proteincoupled receptor signaling pathway and neuropeptide signaling pathway. Real-time PCR was performed to validate the expression of two lncRNAs in brain tissue in the preterm and full-term groups, and the results were consistent with those of the chip assay. Conclusions The expression profiles of lncRNAs in brain tissue change significantly in inflammation-induced preterm mice, and the G protein-coupled receptor signaling pathway may be involved in the pathogenesis of preterm brain injury.
Key words: Long non-coding RNA     Inflammation     G protein-coupled receptor     Mice    

已有大量研究表明母亲宫内感染/炎症反应是导致胎儿早产的重要原因,并对早产儿神经系统发育造成严重影响[1]。近年来,对早产儿脑损伤分子生物学机制的研究取得了很大进展。多种蛋白编码基因及信号通路如 Cdk2基因、Olig2基因、Wnt/β-catenin、STAT-3、Notch信号通路等被证明参与早产脑损伤的发生及发展[2, 3],但未能完全阐明其关键点和机制。

近年来逐渐引起广泛关注的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200 nt的转录本[4, 5]。相比于miRNA及编码基因,lncRNA数量、种类更多,功能及作用机制相对更丰富,通过在染色体、转录、转录后、蛋白等多层次调控基因表达 [6, 7],参与生物体多种生理或病理过程,包括生物进化、细胞周期及机体信号传导,并调控感染、免疫反应的发生发展等[8, 9]。已有研究表明,lncRNA在脑发育及疾病中具有重要作用。如近期研究发现lncRNA表达谱在蛛网膜下腔出血所致早期脑损伤中发生明显变化[10];lncRNA FosDT能通过与相关蛋白互相作用而促进缺血性脑损伤的发展[11]。提示lncRNA的异常表达与脑损伤密切相关,但lncRNA在早产脑损伤中的研究尚未见报道。本研究中,我们应用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为炎症诱导因子,建立早产小鼠脑损伤模型,并采用lncRNA芯片技术筛选与炎症诱导早产脑损伤相关的差异表达lncRNA。本研究首次描述了早产脑损伤相关lncRNA表达谱,为探讨lncRNA与早产脑损伤的关系及其防治提供新思路。

1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂

雌性BALB/c小鼠与雄性C57小鼠由西安交通大学医学院动物中心提供;脂多糖购于美国Sigma公司;GeneChip Mouse Transcriptome(MT)Array1.0芯片购自美国Affymetrix公司;芯片数据分析由上海其明公司提供;TRIzol购自美国Invitrogen公司;RT-PCR试剂盒购于日本 Takara公司;StepOne Plus荧光定量PCR仪购自美国ABI公司;β-actin及2条lncRNA引物由上海生工公司合成。

1.2 炎症诱导早产动物模型制备

成年雌性BALB/c小鼠28只与雄性C57小鼠14只于SPF级环境饲养。按雌雄2 : 1合笼,以检查到母鼠出现阴栓为妊娠0 d。将孕鼠随机分为对照组和LPS组单独饲养,每组14只。妊娠17 d时,LPS组于不同时间点连续两次腹腔注射LPS(血清型 055:B5,美国Sigma公司)50 μg/kg,对照组注射相同剂量磷酸盐缓冲液。对照组孕鼠于妊娠21 d时分娩的小鼠纳入足月组,LPS组孕鼠于妊娠18 d时分娩的小鼠纳入早产组[12]

1.3 脑组织病理学检查

两组各取6只仔鼠脑组织,去除小脑及脑干后置于4%多聚甲醛中固定,梯度乙醇脱水。常规石蜡包埋,冠状面切片厚度10 μm、行苏木精-伊红(HE)染色,40倍光镜下观察脑组织病理学变化。

1.4 芯片选择与探针设计

利用 Gene Chip Mouse Transcriptome(MT)Array 1.0芯片,该芯片覆盖NCBI RefSeq、Ensemble、NONCODE、lncRNA db等多个权威数据库,可检测约55 000条lncRNA。芯片的探针为长度25-mer的寡核苷酸,用于芯片杂交中质量评估的外标基因有BioB、BioC、BioD和Cre X。

1.5 样本总RNA的提取与检测

两组各取3只仔鼠脑组织,用TRIzol提取脑组织样本总RNA。紫外分光光度计检测总RNA浓度及A260/A280,结合琼脂糖凝胶电泳图,分析样本总RNA质量。

1.6 芯片实验

两组各取3只仔鼠脑组织,按照Affymetrix公司的GeneChip WT PLUS Reagent Kit试剂盒说明书合成ss-cDNA,并对ss-cDNA进行片段化、标记,再与Affymetrix的基因芯片杂交。杂交后应用 Fluidics Station 450对芯片进行洗染。应用Affymetrix的GeneChip Scanner 3000 7G扫描仪对芯片的荧光强度进行扫描,再将CEL文件输入Expression Console软件进行数据标准化处理。以上芯片实验由上海其明公司完成。

1.7 Real-time PCR验证

选取2条lncRNA进行real-time PCR验证,以β-actin为内参基因,引物序列见表 1。两组各取3只仔鼠脑组织,用TRIzol提取脑组织样本总RNA,将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板,采用Step One Plus荧光定量PCR仪,SYBR Green荧光染料法进行相对定量。采用20 μL反应体系,含SYBR Premix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,cDNA模板2 μL,DEPC水7 μL。反应条件:95℃变性30 s;95℃变性5 s,60℃退火30 s,35个循环。结果以Ct值表示,采用2-△△Ct法比较lncRNA在早产组和足月组小鼠脑组织中的表达差异。

表 1 lncRNA 及β-actin 引物序列
1.8 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x ±s)表示,采用独立样本t检验比较lncRNA在两组样本中的表达差异,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 脑组织病理学改变

肉眼可见早产组小鼠脑组织充血、肿胀明显。光镜下观察:早产组小鼠脑组织细胞排列疏松,并出现大面积坏死灶,灶内神经元广泛溶解、消失,出现大量泡沫细胞;而足月组小鼠脑组织细胞排列较整齐紧密,细胞形态正常,未见明显坏死灶及泡沫细胞。见图 1

图 1 新生鼠脑组织苏木精-伊红染色 (×40) 足月组小鼠脑组织细胞排列紧密,未见坏死灶;早产组小鼠脑组织可见坏死灶。N 为坏死灶。
2.2 总RNA样本质检结果

所有样本总RNA的A260/A280值均在1.8~2.2之间,琼脂糖凝胶电泳可见28S和18S两条核糖体RNA条带(图 2),质量检测结果全部通过(表 2),可用于后续芯片检测。

图 2 脑组织样本总RNA 电泳图 M 为Marker;1~3分别为早产组小鼠脑组织3 个样本;4~6 分别为足月组小鼠脑组织3 个样本。

表 2 小鼠脑组织RNA 质检结果
2.3 芯片杂交结果

将质检合格的6份样本进行芯片检测,结果显示:在早产组与足月组中,显著差异表达的lncRNA共有1 978条(取P<0.05),包括上调lncRNA 786条,下调lncRNA 1 192条。其中差异表达1.5倍及以上的lncRNA共有29条。通过NONCODE数据库(www.bioinfo.org/NONCODEv4)对差异表达倍数最高的前10条lncRNA进一步分析,发现这些lncRNA参与众多生物学过程,如转录、信号转导、凋亡、细胞周期、炎症反应等,同时,还与G蛋白偶联受体(GPCRs)信号通路、神经肽信号通路有关(表 3)。

表 3 差异表达倍数最高的前10条lncRNA
2.4 Real-time PCR结果

应用Real-time PCR对2条lncRNA在早产组和足月组脑组织中的表达进行验证,发现与芯片结果一致(图 3)。

图 3 Real-time PCR 检测脑组织差异表达lncRNA n=3) lncRNA KnowTID_00002271、NONMMUT036082 在早产组小鼠脑组织中表达明显上调,与芯片结果一致。a示与足月组比较,P<0.01。
3 讨论

已有研究表明,lncRNA在多种神经系统疾病中发挥重要作用。如lncRNA BDNF-AS参与亨廷顿病、精神分裂症、抑郁症等的发生发展[8];lncRNA BACE1-AS在阿尔兹海默病患者脑组织中上调表达,与其发病机制密切相关[13]。然而lncRNA在与早产导致的脑损伤、脑发育异常的相关研究尚未见报道。高通量lncRNA芯片技术为寻找早产脑损伤诊治靶点提供了捷径。本研究成功建立了宫内炎症诱导早产小鼠脑损伤模型,通过lncRNA芯片技术对早产及足月产小鼠脑组织中lncRNA的表达谱进行分析。研究发现,在两组小鼠脑组织中,显著差异表达的lncRNA共有1978条,上调表达的lncRNA有786条,下调表达的lncRNA有1192条。这提示,脑损伤早产鼠脑组织中的lncRNA表达谱发生了明显变化,这些表达变化的lncRNA可能参与了早产脑损伤的发病过程。

脑发育过程中涉及一系列复杂的分子事件,需要对基因的时空表达进行精确的调控,从而形成复杂的神经网络系统[14]。lncRNA在发育及成熟的大脑中广泛表达[15],能够在多层面调控编码基因表达。如在表观遗传水平调节DNA甲基化、调节组蛋白修饰、调节基因组印记、诱发染色体重组等;lncRNA还可以通过与编码基因相互作用形成小干扰RNA调节基因表达水平等方式参与生物体多种生理或病理过程。为阐明lncRNA在早产脑损伤中的功能,本研究进一步对差异表达倍数较高的lncRNA进行分析后发现,这些变化的lncRNA参与众多生物学过程,如转录、信号转导、凋亡、细胞周期、炎症反应等。因此我们推测,lncRNA在早产脑损伤的发生中可能具有重要的作用,但其具体作用方式还需进一步研究。同时,还发现差异表达的lncRNA与GPCRs等信号通路相关,提示GPCRs可能参与了早产脑损伤的调控。GPCRs是人类最大的一类跨膜受体家族,具有丰富的种类和功能,通过与相应配体结合,完成细胞内外的信号转导。GPCRs介导的信号通路对体内神经系统、心血管系统、免疫系统、肿瘤的发生发展等发挥广泛调控作用,并与多条信号通路如Wnt、MAPK等信号通路具有交互作用。GPCRs被证明在神经系统的发育及疾病中有重要作用。如近年来研究较多的GPR56能够调控少突胶质细胞发育[16];其与配体collagen Ⅲ结合可激活RhoA信号通路,在脑皮质发育和分层中发挥重要作用[17, 18]。其他GPCRs如GPR3、GPR17等也被报道与神经系统发育密切相关。但至今尚无GPCRs与lncRNA在早产脑发育中相互作用关系的报道,二者是否以配体受体结合的方式发挥作用还不得而知,因此可将其作为下一步研究的一个新思路。

越来越多的研究表明lncRNA在神经系统发育及疾病中具有重要作用。而相对于蛋白编码基因,lncRNA在神经系统中的研究在国内外还处于起步阶段。我们虽然已筛选出在早产小鼠脑组织中差异表达的lncRNA,并对其表达谱进行了初步分析,但对于这些lncRNA的功能及与编码基因的作用关系还不明确。后续研究中,我们将建立lncRNA与编码基因等的共表达网络,并通过lncRNA相关生物技术对lncRNA的功能及作用机制进行深入探讨。

参考文献
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