川崎病（Kawasaki disease,KD）又称皮肤粘膜淋巴结综合征，是一种好发于5 岁以下儿童的急性发热出疹性疾病，常伴有冠状动脉损害^[1]。其发病机制尚不清楚，目前考虑该病与免疫紊乱引起的炎症因子及趋化因子异常增高有关。研究发现，辅助性T 细胞（T helper cells,Th）在KD 的发病中起着重要作用，Th9 是近年来发现的一种新型辅助性T 细胞亚群，特征性分泌白介素-9（IL-9），在多种自身免疫性疾病、过敏性疾病及感染性疾病中发挥重要作用，主要机制是促使炎症细胞活化，分泌相关炎症因子及趋化因子，并产生级联反应从而导致炎性损伤。那么，KD 作为一种自身免疫紊乱导致的血管炎性疾病，Th9 细胞及IL-9 是否在该病的发生发展及转归中发挥作用，目前尚未见报道。本研究通过检测KD 患儿急性期外周血Th9 细胞及IL-9 的表达，探讨两者在KD 发病过程中的作用。

选取2014 年4 月至2015 年7 月于滨州医学院附属医院儿科初诊且处于急性期（病程7 d 内）的45 例KD 患儿，年龄3 个月至5 岁，平均年龄为1.7±0.8 岁，其中男性25 例、女性20 例；并对39 例患儿进行了恢复期（病程21~60 d）随访。所有患儿急性期均有发热，皮疹40 例，颈部非化脓性淋巴结肿大30 例，眼结合膜充血32 例，草莓舌35 例，手足硬性水肿20 例。同期健康体检儿童45 例作为对照组，年龄5 个月至6 岁，平均年龄2.0±0.9 岁，其中男性22 例、女性23 例。KD 组与对照组性别、年龄比较，差异无统计学意义（χ²=0.401、t=0.824，P>0.05）。并收集患者入院时的C 反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、血沉（ESR）、血小板（PLT）、球蛋白、血浆白蛋白。本研究获得患儿监护人知情同意及医院伦理委员会批准。

川崎病诊断及分期符合川崎病诊断指南第 5次修订版标准^[2-3]。入院前均未予免疫球蛋白及阿司匹林等任何治疗，入院前2 周内未使用过免疫抑制剂及激素类药物；排除其他感染性、过敏性及自身免疫性疾病。

KD 组在急性期（病程7 d 内，接受阿司匹林及大剂量丙种球蛋白治疗之前）、恢复期（病程21~60 d）以及健康对照组分别清晨空腹采集静脉血4 mL，置于促凝管，2 mL 血离心后取血清冻存于-80℃冰箱待测IL-9；另外2 mL 血经Ficoll 密度梯度离心法分离单个核细胞（PBMC），显微镜下计数，用含10% 胎牛血清的1640 培养基调整细胞密度为5×10⁶/ mL，依次加入佛波酯、离子霉素、莫能菌素刺激，终浓度分别为50 ng/mL，1 μg/mL，1 μg/mL。于37℃、5％ CO₂ 培养箱中培养6 h，PBS 洗涤2 次，每 1×10⁶/mL 细胞中分别加入别藻蓝蛋白（APC）- 抗人CD3 抗体、异硫氰酸荧光素（FITC）- 抗人CD8 抗体各5 μL 进行荧光标记抗体表面染色，再4℃避光孵育30 min。然后进行细胞固定、破膜、细胞内染色，每1×10⁶/mL细胞和阴性对照管均加入抗 IL-9- 藻红蛋白5 μL、同样荧光标记的非特异性同型抗体IgG 5 μL。4℃避光孵育25 min，再次用PBS 洗涤2 次，固定，等待检测。CD3⁺CD8^-IL-9⁺T 细胞即为外周血Th9细胞。

将冻存于-80℃的血清常温下放置30 min，运用ELISA 试剂盒（美国Rapid BioLab 公司）检测IL-9，操作按照试剂盒说明书进行。

所有数据均采用SPSS 22.0 软件进行分析处理，计量资料采用均数± 标准差（(x±s)）表示；组间均数比较采用t 检验；相关性分析采用Spearman相关性分析。P<0.05 为差异具有统计学意义。

KD 急性期Th9 的表达[（0.62±0.11）%] 高于恢复期[（0.31±0.14）%] 及对照组[（0.25±0.08）%]，差异具有统计学意义（t=9.436、10.625，P<0.05）；患儿恢复期Th9 细胞水平与对照组比较，差异无统计学意义（t=1.083，P>0.05）。各组患儿的Th9 流式细胞检测见图 1~3。

图 1 流式细胞术检测KD 患者急性期Th9 细胞 A：FSC-SSC 设门淋巴细胞群；B：设门CD3+CD8-T 淋巴细胞群；C：CD3+CD8-IL-9+T（Th9）细胞亚群。UR 示Th9 细胞亚群所占百分比。

图 2 流式细胞术检测KD 患者恢复期Th9 细胞 A：FSC-SSC 设门淋巴细胞群；B：设门CD3+CD8-T 淋巴细胞群；C：CD3+CD8-IL-9+T（Th9）细胞亚群。UR 示Th9 细胞亚群所占百分比。

图 3 流式细胞术检测正常对照组Th9 细胞 A：FSC-SSC 设门淋巴细胞群；B：设门CD3+CD8-T 淋巴细胞群；C：CD3+CD8-IL-9+T（Th9）细胞亚群。UR 示Th9 细胞亚群所占百分比。

KD 患儿急性期IL-9 水平高于恢复期及对照组（81±21 pg/mL，42±13 pg/mL，36±12 pg/mL），差异具有统计学意义（t=8.647、9.064，P<0.05）；恢复期患儿与对照组比较，差异无统计学意义（t=1.474，P>0.05）。

KD 患儿急性期Th9 的表达水平与CRP、PCT、ESR、PLT、球蛋白水平呈正相关，具有统计学意义（P<0.05）；而与白蛋白水平呈负相关，具有统计学意义（P<0.05）。见表 1。

表 1

表 1 KD 急性期Th9 细胞表达水平与各临床指标的相关性

表 1 KD 急性期Th9 细胞表达水平与各临床指标的相关性

KD 患儿急性期IL-9 的表达水平与CRP、PCT、ESR、PLT、球蛋白水平呈正相关，与白蛋白水平呈负相关，具有统计学意义（P<0.05），见表 2。

表 2

表 2 KD 急性期IL-9 与各临床指标的相关性

表 2 KD 急性期IL-9 与各临床指标的相关性

川崎病（KD）是一种自身免疫性血管炎性疾病，主要影响中小动脉，尤其是冠状动脉，25%可能发展为冠状动脉瘤、冠脉狭窄或血栓形成，甚至猝死^[4]。目前，KD 的发病机制尚不明确，大多数学者认为与免疫系统高度活化导致的异常自主反应有关。近年来，辅助性T 细胞与KD 发病关系的研究越来越多，被认为在KD 的发病中起着重要作用。

CD4⁺T 细胞是导致自身免疫性疾病的主要淋巴细胞。Th9 细胞是新近发现的不同于Th1，Th2，Th17 及调节性T 细胞（T regulatory cell,Treg）的新型CD4⁺T 细胞亚群，在细胞因子TGF-β和IL-4 联合诱导下分化，分泌特异性细胞因子IL-9。IL-9 与其受体结合形成异二聚体，通过介导JAK/STAT 等信号通路，作用于肥大细胞，启动一系列炎症反应，发挥其生物学作用^[5]。多项研究发现，Th9 细胞在多种自身免疫性疾病、过敏性疾病及感染性疾病中发挥重要作用。例如：系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）患者的血清IL-9 水平高于健康对照组，提示IL-9 参与SLE 的发病过程^[6]。Ciccia 等^[7] 研究报道，类风湿关节炎患者关节滑液中Th9 细胞明显增高，相关细胞因子IL-9、IL-4、TGF-β 及特异性转录因子PU.1 均增高。Li 等^[8] 研究发现，使用抗IL-9 单克隆抗体中和 IL-9 或者IL-9 受体缺陷均能减轻小鼠自身免疫性脑脊髓炎的严重程度，可能与IL-9 可诱导星形胶质细胞分泌其他炎症因子及趋化因子，募集Th17 细胞及IL-6 在中枢神经系统聚集，从而产生炎症损伤有关。另外，Yao 等^[9] 在实验性自身免疫性肌无力小鼠模型中证实，Th9 细胞增多伴随IL-9 上调；用IL-9 抗体阻断IL-9 通路可降低血清抗乙酰胆碱受体IgG 水平，减轻小鼠的病理症状；中和IL-9，可增加辅助性T 细胞向Treg 细胞的转化，发挥治疗作用。然而目前，Th9 细胞及细胞因子IL-9 在KD 发病机制中的作用国内外尚无报道。本研究通过检测Th9 细胞及IL-9 在KD 患儿外周 血中的表达情况，探讨其在儿童KD 发病中可能的 作用。

本研究发现，KD 患儿急性期外周血Th9 细胞及其细胞因子IL-9 水平明显高于恢复期及对照组患儿，而恢复期患儿与对照组之间差异无显著性，提示Th9 细胞及其细胞因子IL-9 可能参与KD 的发生发展。同时，有研究证实Th9 细胞与Th17 细胞功能极其相似，参与多种自身免疫性疾病^[10]。Rasouli 等^[11] 发现KD 患儿急性期血清Th17，IL-17，IL-22，IL-23 均增高，静脉免疫球蛋白及阿司匹林治疗后Th17 细胞及相关细胞因子均下调。因此，我们推测针对KD 急性期增高的Th9 及IL-9进行干预，可能为KD 的治疗提供新的思路。CRP、PCT、ESR、PLT、白蛋白、球蛋白是重要的判断炎症活动性的常用指标。有研究证实，CRP、ESR、WBC、PLT 等指标与川崎病的炎症程度成正相关，急性期明显高于恢复期及健康对照组，被广泛用于KD 急性期评估^[12-13]。2004 年，美国心脏学会在制定KD 诊断评估指南时，也将CRP、ESR、PLT 等作为评价KD 炎症程度的实验室指标和不完全川崎病的参考诊断^[14]。本实验对川崎病患者急性期外周血Th9 细胞及血清IL-9 与CRP、PCT、ESR、PLT、白蛋白、球蛋白进行相关性分析发现，KD 患儿急性期Th9 细胞及IL-9 的表达水平与患者的CRP、PCT、ESR，PLT、球蛋白呈正相关、与白蛋白呈负相关，因此，推测Th9细胞及IL-9 可能可作为反映KD 患儿疾病活动性的新指标。

综上所述，KD 患儿急性期外周血Th9 细胞比例和IL-9 水平均高于恢复期及健康对照组，且与CRP、PCT、ESR、PLT、球蛋白呈正相关，白蛋白水平呈负相关，提示Th9 细胞可能通过分泌IL-9 参与了KD 的致病过程，并且与疾病的发生、发展及转归密切相关，推测其可在不典型川崎病的早期具有诊断价值，可能为自身免疫性疾病的治疗提供新思路。然而对Th9 细胞与KD 的具体机制及作用通路还需要大样本及更深入的研究。