哮喘是常见的慢性呼吸道疾病之一，其发病率近年明显增加，目前仍是全球性的主要公共卫生问题^[1]。据估计全球有约3亿哮喘患者，且儿童哮喘患病率高于成人，严重威胁青少年身体健康^[2]。积极防治小儿支气管哮喘可防止气道不可逆性狭窄和气道重塑。

KyoT是一种LIM结构域蛋白，有两种类型：KyoT1和KyoT2蛋白，其中KyoT2可与RBP-Jκ相互作用^[3]。有研究表明，在哮喘型小鼠中，过表达KyoT2抑制气道重塑^[4]。气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells, ASMC）增殖和迁移参与哮喘的发生发展，是哮喘过程中重要的病理学变化^[5]。KyoT2对ASMC的增殖和迁移作用尚未见报道。本研究拟通过卵白蛋白（ovalbumin, OVA）建立小鼠哮喘模型，观察KyoT2在哮喘小鼠ASMC中的表达；分离正常和哮喘小鼠的ASMC，探讨KyoT2对哮喘小鼠ASMC增殖和迁移的作用及可能的机制，为KyoT2防治哮喘气道重塑提供实验依据并奠定理论基础。

OVA（Sigma公司，美国），胎牛血清（Hyclone，美国），0.25%胰蛋白酶和D-Hanks液（JRH公司，美国），MTT试剂盒（上海碧云天公司），BrdU试剂盒（Roche公司，瑞士），AKT、p-AKT、Myc和PTEN抗体（Cell Signaling公司，美国），KyoT2抗体（Abcam公司，美国），RBP-Jκ（Santa Cruz公司，美国），HRP标记的二抗（北京中杉金桥公司），Transwell小室（Corning公司，美国）。

3周龄SPF级雌性BALB/c小鼠16只，体重18~22 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，随机分成对照组和哮喘组，每组8只。小鼠哮喘动物模型的建立参照文献^[6]后略加改动，哮喘组小鼠于第0天和第14天腹腔注射致敏液0.1 mL/只，致敏液中含20 μg OVA和0.1 mL氢氧化铝凝胶；第21~27天以0.5%的OVA溶液雾化激发，每次20 min。对照组给予相同体积的生理盐水致敏、雾化。两组小鼠于最后1次雾化吸入后24 h颈椎脱臼处死，取气管作ASMC分离培养实验。

运用组织贴块分离培养ASMC。小鼠经断颈处死，迅速分离气管部分，置入含有青霉素的D-Hanks溶液中，剥离外膜并刮除内膜，将气管小心剪成约1 mm³组织块，贴于培养皿底部，加入含20%胎牛血清的完全培养基。显微镜下观察组织块外缘细胞融合度达80%时，进行首次传代，按照1：2传代。

过表达KyoT2的质粒pCMV-Myc-KyoT2和对照质粒pCMV-Myc由上海生工生物公司提供。将哮喘组ASMC接种于培养皿中，随机分为空载体组（转染pCMV-Myc的哮喘组ASMC）和KyoT2过表达组（转染pCMV-Myc-KyoT2的哮喘组ASMC）。无血清培养24 h，采用lipo2000试剂将pCMV-Myc和pCMV-Myc-KyoT2转入ASMC中，5 h后换上完全培养基继续培养48 h，收样后检测KyoT2转染效率。

ASMC经0.25%胰蛋白酶消化后，以1× 10⁷/L的密度接种于96孔培养板中。细胞分为对照组（对照组ASMC）、哮喘组（哮喘组ASMC）、空载体组（转染pCMV-Myc的哮喘组ASMC）和KyoT2过表达组（转染pCMV-Myc-KyoT2的哮喘组ASMC），每组设置3个复孔。每孔加入5 g/L的MTT 20 μg，培养3.5 h后弃培养液，加入150 μL培养液，震荡10 min，选择570 nm波长，采用酶标仪检测各孔490 nm处的吸光度值（OD）。实验独立重复6次。

细胞处理及分组情况同1.5小节，每组设置3个复孔。收样前8~10 h，每孔加入BrdU 10 μL。收样时弃上清，加入200 μL/孔Fix Denat室温反应30 min，弃上清，加入100 μL/孔anti-BrdU-POD工作液，室温反应90 min，弃上清，清洗4次，加入100 μL底物溶液，室温反应15 min。2 mol/L硫酸终止反应。实验独立重复6次。

Transwell板上室和下室之间的聚碳酸酯膜采用I型胶原溶液于4℃过夜反应。ASMC经转染pCMV-Myc和pCMV-Myc-KyoT2 48 h后，消化细胞并计数，用含10%胎牛血清的培养基调整细胞密度为1×10⁵/L，Transwell上室中加入各组细胞悬液100 μL，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培养基。将Transwell小室于37℃孵育6 h，擦去微孔膜上未穿膜的细胞，膜下面的ASMC采用甲醇固定，结晶紫染色10 min，封片，在倒置显微镜下，每组观察4张切片，每张切片随机选取5个视野进行计数，取平均值计算。实验独立重复6次。

ASMC接种于6孔板中，分为对照组、空载体组和KyoT2过表达组。每组设3个平行样本，采用TRIzol提取各组细胞的总RNA。以总RNA为模板，采用逆转录试剂盒合成cDNA，引物由上海生工生物工程公司合成。KyoT2上游引物：5'-GACCAGAACGTGGAGTACAA-3'，下游引物：5'-AGTCAGGGCAATACACCTGC-3'；β-actin上游引物：5'-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3'，下游引物：5'-TTGATGTCACGCACGATTTC-3'。各组取5 μg cDNA为模板，选择25 μL的反应体系，94℃预变性2 min；94℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。每个基因用内参基因β-actin校准。目的基因的相对表达水平依据2^-ΔΔCt法计算。实验独立重复6次。

ASMC接种于6孔板中，分为哮喘组、空载体组和KyoT2过表达组。每组设3个平行样本，提取各组总蛋白。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，每组50 μg蛋白经SDS-PAGE电泳、转膜后，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗4℃反应过夜。加入HRP标记的二抗，室温反应1 h，采用化学发光液进行显色。采用Image J软件分析各个条带的OD值。实验重复6次。

采用SPSS 11.0统计学软件对数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

RT-PCR和Western blot用于检测KyoT2的表达。哮喘组ASMC中KyoT2 mRNA表达较对照组显著下降（P < 0.05）（图 1A）。将Myc-KyoT2转染至哮喘组ASMC中48 h，结果表明哮喘组ASMC中KyoT2蛋白表达较对照组下调（P < 0.05）（图 1B）。

图 1 KyoT2在OVA诱导的哮喘小鼠ASMC中的表达A：RT-PCR检测KyoT2 mRNA表达水平（n=3）；B：Western blot检测KyoT2蛋白表达水平（n=3）。a示与对照组相比，P < 0.05。

采用RT-PCR法检测KyoT2 mRNA表达水平。结果显示，与空载体组比较，过表达KyoT2显著上调其mRNA（图 2A，P < 0.05）和蛋白表达水平（图 2B，P < 0.05）。

图 2 KyoT2的转染效率A：RT-PCR检测KyoT2 mRNA表达水平（n=3）；B：Western blot检测KyoT2蛋白表达水平（n=3）。a示与空载体组相比，P < 0.01；b示与空载体组相比，P < 0.05。

分别采用MTT法和BrdU法检测ASMC增殖。结果显示，KyoT2过表达组细胞增殖速度较空载体组下降（图 3A，P < 0.05）。采用BrdU法进一步验证，KyoT2过表达组细胞BrdU掺入量较空载体组显著减少（图 3B，P < 0.05）。

图 3 过表达KyoT2抑制ASMC增殖A：MTT法检测ASMC增殖（n=3）；B：BrdU法检测ASMC增殖（n=3）。a示与对照组相比，P < 0.05；b示与空载体组相比，P < 0.05。

Transwell法用于检测过表达KyoT2对哮喘组ASMC迁移的作用，结果如图 4所示，哮喘组细胞迁移能力较对照组显著增强，而过表达KyoT2明显抑制OVA诱导的细胞迁移（P < 0.05）。

图 4 过表达KyoT2抑制ASMC迁移（n=4）a示与对照组相比，P < 0.05；b示与空载体组相比，P < 0.05。

KyoT2能负调控RBP-Jκ的活性及表达^[7]，同时RBP-Jκ能与PTEN的启动子结合进一步调控PTEN的表达及下游信号通路^[8]。本研究结果显示，在ASMC中过表达KyoT2能显著抑制RBP-Jκ（图 5A和B）和p-AKT（图 5A和D）的表达而上调PTEN的表达（图 5A和C）（P < 0.05）。

图 5 过表达KyoT2负调控RBP-Jκ/PTEN/AKT信号通路A：Western blot检测RBP-Jκ、PTEN和AKT蛋白表达水平（n=3）；B：RBP-Jκ蛋白相对表达水平统计图（n=3）；C：p-PTEN蛋白相对表达水平统计图（n=3）；D：p-AKT蛋白相对表达水平统计图（n=3）。a示与空载体组相比，P < 0.05

近年来，由于环境污染及社会因素，哮喘发病率显著升高，尤其儿童哮喘的发病率逐年上升^[9]。OVA是常用哮喘致敏原，一般分为单纯和复合两种方式致敏和诱导哮喘。氢氧化铝作为佐剂乳化OVA，多次经腹腔或者皮下致敏后，再滴鼻或者雾化吸入诱导哮喘模型。哮喘作为一种反复性发作的疾病，长期反复发作会使气道发生不可逆的缩窄和重塑^[10]。同时，哮喘发生伴随着ASMC增殖并向气管腔内迁移，进一步促进气道壁增厚^[11]。ASMC的增殖和迁移导致哮喘的加重。KyoT2是Notch 1信号的负性调控因子^[12]，能下调小鼠肺组织Hes1的表达，减轻OVA诱导的哮喘模型小鼠气道上皮下胶原沉积，减轻基底膜的厚度^[4]。本研究证实，过表达KyoT2能抑制哮喘ASMC增殖和迁移，其具体机制可能是通过负调控RBP-Jκ/PTEN/AKT通路实现。

KyoT2是Notch信号通路的负性调控因子，能与其下游分子RBP-Jκ结合抑制Notch信号通路^[13]。本研究发现过表达KyoT2下调RBP-Jκ的表达。同时，PTEN是一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，对细胞的生长、增殖、分化、迁移和血管生长等均有明显的调控作用。研究表明过表达PTEN可通过下调p-Akt的表达，抑制HASMC的增殖和迁移，参与调控气道重塑^[14]。RBP-Jκ能够与PTEN启动子结合调控PTEN基因的表达，进一步调控其下游分子的表达^[8]。本研究结果显示过表达KyoT2显著上调PTEN的表达并抑制p-AKT表达。因此，过表达KyoT2抑制ASMC增殖和迁移可能是通过负调控RBP-Jκ/PTEN/AKT通路实现。

综上所述，过表达KyoT2抑制ASMC增殖和迁移，其可能的机制是通过负调控RBP-Jκ/PTEN/AKT信号通路实现。提示KyoT2可能作为防治哮喘的靶分子，为KyoT2预防哮喘气道重塑提供实验依据和新的思路。