肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，SP）是引起鼻窦炎、急性中耳炎的最常见病因，更是导致婴幼儿脑膜炎、菌血症、肺炎等严重疾病的首要病原菌^[1]。SP感染性疾病是全球5岁以下儿童高居第一位的死亡病因^[2]。临床抗生素大量经验性应用，耐药情况日趋加重。短腭、肺及鼻咽上皮克隆1（short palate，lung，and nasal epithelium clone 1，SPLUNC1）是新近发现具有抗菌活性的天然免疫蛋白，由呼吸道上皮细胞分泌，研究证实，细菌暴露后，SPLUNC1可对其结合包裹，通过调节离散小孔的形成增加细菌细胞膜通透性，抑制细菌生长，随感染加重，SPLUNC1可驱动中性粒细胞及巨噬细胞的迁移，启动适应性免疫反应，相关炎症因子的分泌又可抑制SPLUNC1的表达^[3-6]。白藜芦醇（resveratrol，Res）提取自虎杖根茎，是最强的天然SIRT1激活剂，能通过抑制NF-κB在机体免疫防御系统起抗炎作用^[7-9]。我们推测Res预处理BEAS-2B细胞，可以通过抑制NF-κB炎症信号通路，下调相关炎症因子，影响SPLUNC1的表达。SP感染领域SPLUNC1、Res研究甚少，Res对 SPLUNC1表达的影响更是尚无定论。本实验建立SP感染人支气管上皮细胞（BEAS-2B细胞）模型，以不同浓度Res预处理，在各感染时间点进行细胞活性、SPLUNC1表达量检测，探讨SP感染时SPLUNC1的宿主防御作用，及Res对SPLUNC1表达的影响，为SP感染性疾病的治疗提供新的思路。

SP（ATCC 49619）由首都医科大学附属北京儿童医院杨永弘教授馈赠。BEAS-2B细胞购自中科院上海细胞生物研究所细胞库。

胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶（0.25%EDTA）（美国Gibco公司），TRIzol（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒（美国Fermentas公司），Lightcycle 480 SYBR GreenⅠMaster（美国Roche公司），Cell Counting Kit -8（CCK8）试剂盒（日本株式会社同仁化学研究所），Res（美国Sigma公司），SPLUNC1 ELISA试剂盒（上海酶研生物科技有限公司），哥伦比亚血琼脂培养基（温州康泰生物科技有限公司），奥普托欣试纸（杭州微生物试剂有限公司），PCR primer（上海捷瑞生物工程有限公司），二级生物安全柜（美国Forma公司），超净工作台、CO₂培养箱（Heal Force90）（美国Thermo公司），实时荧光定量PCR仪（Lightcycle 480）（美国Roche公司），低温高速离心机（德国Hettich公司），酶标仪（ELX808IU）（美国Bio-Tek公司）。

BEAS-2B细胞分别接种于25 cm²培养瓶中，使细胞生长于含10% FBS的DMEM培养基，置37℃、5% CO₂培养箱中培养，用胰蛋白酶（0.25% EDTA）常规消化传代。

用灭菌接种环将SP接种于哥伦比亚血琼脂平板，置于37℃、5%CO₂培养箱中，传代2次至生长旺盛，用灭菌环刮取单个细菌菌落，接种至装有5 mL脑心浸液肉汤的玻璃试管中增菌，离心、洗涤、重悬细菌，取适量菌液加入含10% FBS的DMEM培养液中，用麦氏比浊仪调整菌悬液至所需浓度。

根据感染复数（MOI）不同将SP感染BEAS-2B细胞分为对照组、MOI20 SP组和MOI50 SP组；根据Res药物浓度不同将Res预处理MOI20 SP感染BEAS-2B细胞分为12.5Res+SP组、25Res+SP组、50Res+SP组。将BEAS-2B细胞按1×10⁴个/孔接种于96孔板，置37℃、5% CO₂培养箱中培养，待细胞生长至70%~80%融合，取出96孔板，用无菌PBS溶液冲洗细胞，分别向12.5Res+SP组、25Res+SP组、50Res+SP组加入Res（终浓度分别为12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L）无双抗培养液，余各组加入等量新鲜无双抗培养液，放置培养箱孵育24 h，取出96孔板，向MOI20 SP组、12.5Res+SP组、25Res+SP组、50Res+SP组加入菌悬液（MOI 20），向MOI50 SP组加入菌悬液（MOI 50），放置培养箱孵育，于感染后0、3、6、12、18 h取出相应96孔板，用于CCK8法检测细胞活力。以此就SP、Res不同作用浓度及时间对BEAS-2B细胞活性的影响进行分析讨论，并选出SP、Res最佳作用浓度及时间进行后续研究。

从培养箱中取出96孔板，用无菌PBS溶液冲洗细胞，向每孔加入新的培养基及10 μL CCK-8溶液。继续培养45 min，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。每组设6个复孔，实验独立重复3次。

实验分为对照组、Res组、SP组和Res+SP组。将BEAS-2B细胞按5×10⁵个/皿接种于6 cm细胞培养皿中，置37℃、5% CO₂培养箱中培养，待细胞生长至70%~80%融合，取出培养皿，用无菌PBS溶液冲洗细胞，向Res组及Res+SP组加入Res（终浓度25 μmol/L）无双抗培养液，余各组加入等量新鲜无双抗培养液，放置培养箱孵育24 h，向SP组和Res+SP组加入SP菌悬液（MOI 20），于感染后0、3、6 h，收集各组细胞培养上清液，用于ELISA检测SPLUNC1蛋白表达；无菌PBS溶液冲洗细胞，提取细胞总RNA，用于实时定量（qRT-PCR）检测SPLUNC1 mRNA水平。

按照试剂盒要求提取细胞总RNA并反转录成cDNA，最后进行qRT-PCR检测。反应体系为20 μL，包括cDNA 2 μL、SYBR 10 μL、上下游引物各1 μL、DEPC水6 μL。SPLUNC1基因上游引物序列为：5'-TGAGAGATAAGCAGGAGAGG-3'，下游引物序列为：5'-AAGTCCATCAAGCAGAG-AAA-3'，扩增产物大小为102 bp。内参基因β-actin上游引物序列为：5'-CTACCTCATGAAGATCCTCA-CCGA-3'，下游引物序列为：5'-TTCTCCTTAATGTC-ACGCACGATT-3'，扩增产物大小为84 bp。反应程序如下：95℃ 5 min；95℃10 s、60℃10 s、72℃10 s，45个循环。每组设3个平行样本，实验独立重复3次。数据以2^-ΔΔCt进行分析。

按照试剂盒要求收集细胞培养上清液，应用双抗体夹心法测定SPLUNC1蛋白表达量，最后使用酶标仪测定450 nm处吸光度值（OD值），绘制标准曲线，根据样本OD值确定实际浓度。每组设3个复孔，实验独立重复3次。

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

以感染复数（MOI）不同将SP感染BEAS-2B细胞分为对照组、MOI20 SP组和MOI50 SP组；结果显示MOI50 SP组随感染时间延长，细胞活性显著降低（P<0.05）；在感染后18 h时，与对照组相比，MOI50 SP组细胞活性显著降低（P<0.01）；提示MOI50 SP组较MOI20 SP组细胞损伤更明显，SP感染对BEAS-2B细胞活性的影响具有时间及浓度依赖性（表 1）。根据Res药物浓度不同将Res预处理MOI20 SP感染BEAS-2B细胞分为12.5Res+SP组、25Res+SP组、50Res+SP组。结果显示不同浓度Res+SP组随时间延长，细胞活性显著降低（P<0.05）；在3 h和6 h时，25 Res+SP组细胞活性显著高于MOI20 SP组（P<0.05），在12 h和18 h时，50Res+SP组细胞活性显著低于MOI20 SP组（P<0.05）；提示RES预处理对SP感染BEAS-2B细胞活性的影响具有时间及浓度依赖性，低 Res可增强SP感染BEAS-2B细胞活性，而高浓度Res可抑制SP感染BEAS-2B细胞活性（表 2）。

表 1

表 1 SP感染对BEAS-2B细胞活性的影响 （x±s，n=3）

表 1 SP感染对BEAS-2B细胞活性的影响 （x±s，n=3）

表 2

表 2 Res预处理对SP感染BEAS-2B细胞活性的影响 （x±s，n=3）

表 2 Res预处理对SP感染BEAS-2B细胞活性的影响 （x±s，n=3）

SP组和Res+SP组随感染时间延长，BEAS-2B细胞SPLUNC1 mRNA表达水平增高，3 h达到峰值，6 h下降（P<0.05）；与SP组比较，Res+SP组SPLUNC1 mRNA表达水平在3 h和6 h均显著增高（P<0.05）（表 3）。与对照组相比，Res组SPLUNC1 mRNA表达稳定，随时间延长未见明显改变（P>0.05）（表 3）。各组SPLUNC1蛋白表达情况与SPLUNC1 mRNA表达水平变化相一致，见表 4。

表 3

表 3 各组BEAS-2B细胞SPLUNC1 mRNA相对表达量比较 （x±s，n=3）

表 3 各组BEAS-2B细胞SPLUNC1 mRNA相对表达量比较 （x±s，n=3）

表 4

表 4 各组BEAS-2B细胞SPLUNC1蛋白表达量比较 （pg/mL，x±s，n=3）

表 4 各组BEAS-2B细胞SPLUNC1蛋白表达量比较 （pg/mL，x±s，n=3）

SP为革兰阳性菌，成双或短链状排列，电镜下菌体似矛头状，其致病性与其毒力因子密切相关，主要包括荚膜多糖、SP相关蛋白、细胞壁与细胞壁多糖^[10-11]。本研究以MOI20、MOI50 SP分别感染BEAS-2B细胞，结果显示随感染时间延长，细胞活性降低，说明SP感染对BEAS-2B细胞的损伤具有时间依赖性，较MOI20组相比，MOI50组细胞损伤更显著，说明SP感染致细胞损伤具有浓度依赖性。故本研究选取MOI20 SP感染18 h内进行后续实验，期间细胞活性较对照组相比，差异无统计学意义，可以认为SP感染不影响细胞的正常生长，后续实验结果具有可比性。

SPLUNC1是具有抗菌活性的天然免疫蛋白质，研究证实，SPLUNC1可通过抑制病原体生长、增强呼吸道表面活性及促进纤毛清除等发挥先天免疫作用，并在必要时启动适应性免疫反应，有效抵御革兰阴性菌、肺炎支原体的侵袭^[12-17]。本研究以MOI 20 SP感染人支气管上皮BEAS-2B细胞，qRT-PCR、ELISA结果均显示细胞SPLUNC1高水平表达，说明SP感染可以诱导SPLUNC1的表达。感染初期SPLUNC1分泌量相对较少，尚不能发挥细胞保护作用，直至3 h分泌达高峰，足以有效减少SP感染对细胞的损伤，维持细胞活性的稳定，SP感染3~6 h期间细胞活性趋于稳定，降低较缓慢，相关研究证实适应性免疫反应的激活可以抑制SPLUNC1的表达^[4]，随着SP感染加重，适应性免疫反应启动，SPLUNC1分泌受到抑制，细胞保护作用再次减弱，感染6 h SPLUNC1分泌明显减少，细胞损伤迅速加重。Britto等^[4]研究显示革兰阴性菌感染后小鼠支气管肺泡灌洗液中SPLUNC1蛋白表达增加，达高峰后下降，而SPLUNC1 mRNA表达呈持续下降趋势，并无增加阶段，这与本次实验结果不一致，考虑与本研究为细胞体外培养，自身SPLUNC1 mRNA储存不足有关。本次实验SPLUNC1 mRNA与蛋白高峰同时出现，较mRNA表达相比，蛋白分泌并未滞后，可能与检测时间点设置略少有关，结果显示了先增高后减少的趋势，却未能捕捉到真正的高峰点。

Res属于非黄酮类多酚化合物，在抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化等多方面发挥作用^[7-9]。本实验以不同浓度Res预处理BEAS-2B细胞，结果显示SP感染0 h时，各浓度Res+SP组较MOI20 SP组相比，细胞活性水平基本一致，差异无统计学意义，说明Res药物预处理不影响细胞的正常生长，后续实验结果具有可比性。SP感染后，25Res+SP组细胞活性增强，50Res+SP组显著降低，说明Res可以浓度依赖的方式发挥细胞保护作用。随SP感染时间延长，各组细胞活性均呈降低趋势，较MOI20 SP组相比，25Res+SP组6 h后下降更迅速，提示Res的细胞保护作用具有时间依赖性。故本研究选用25 μmol/L Res预处理BEAS-2B细胞，SP感染6 h内进行后续实验，期间Res具有显著的细胞保护作用。结果显示较SP组相比，Res+SP组SPLUNC1高水平表达，同期细胞活性更好，提示Res可以通过上调SPLUNC1的表达减少SP感染对细胞的损伤。较对照组相比，Res组SPLUNC1表达水平稳定，随时间延长未见明显变化，说明未感染SP状态下，Res不影响SPLUNC1的表达。

SPLUNC1制剂及Res相关药物的研发可能将为儿童SP感染性疾病的治疗提供新的思路，或许有助于减少抗生素的使用，改善抗生素耐药情况。