患儿，男，3岁9个月，因发热20 d入院。患儿入院前20 d受凉后出现不规则发热，热峰39.5℃左右，伴阵发性腹痛（脐周为主），无咳嗽、咳痰、流涕，无寒颤、抽搐、惊厥，无皮疹、关节疼痛，无头痛、恶心、呕吐等，在当地医院予以抗感染（具体用药不详）治疗，效果欠佳。起病以来，患儿神志清楚、热退后精神、食欲可，大小便正常。

既往体健。出生史、喂养史、生长发育史、家族史均无特殊。

入院体查：体温39.0℃，脉搏132次/min，呼吸26次/min，血压96/62 mm Hg，体重15 kg。神志清楚，精神差，全身皮肤无苍白、黄染、色素脱失斑及出血点，颈部及腹股沟可触及数个肿大淋巴结，最大约2 cm×1 cm，质中，无压痛，活动度可。球结膜无充血，眼球无震颤，瞳孔等大等圆、对光反射灵敏。口唇无发绀，口腔黏膜无破溃，无异常分泌物，咽充血，双侧扁桃体Ⅱ°肿大。心肺无异常。腹平软，肝脏肋缘下约3 cm、剑突下约4 cm，脾肋下约3.5 cm，质韧、界清、无压痛，肠鸣音正常。脊柱四肢无畸形。肛门外生殖器无异常，神经系统体查无异常。

实验室检查：血常规白细胞2.6×10⁹/L、中性粒细胞0.2×10⁹/L、血小板93×10⁹/L、血红蛋白72.0 g/L；大小便常规、心肌酶、肾功能、免疫球蛋白、心电图均未见明显异常；电解质：钠122 mmol/L（正常范围：135~153 mmol/L），余项正常；C-反应蛋白6.88 mg/L（正常范围：0~5 mg/L）；降钙素原0.43 ng/mL（正常范围：0~0.20 ng/L）；EB病毒IgM、 IgG均阳性，EB病毒DNA 6.59×10³/mL（<5.0×10²/mL）；肝功能：谷丙转氨酶234 U/L（正常范围：0~40 U/L）、谷草转氨酶195 U/L（正常范围：0~40 U/L），甘油三酯2.30 mmol/L（正常范围：<1.7 mmol/L）；血清铁蛋白1 286.9 ng/mL（正常范围：30~400 U/L）；凝血功能：FIB 1.1 g/L（正常范围：2.0~4.0 g/L）、APTT 51 s（正常范围：26~40 s）、TT 20 s（正常范围：10~18 s）、D-Dimer 2.3 mg/L（正常范围：0~0.3 mg/L），余正常；NK细胞百分比2.0%（正常范围：5.0%~27.0%），NK细胞绝对计数280/μL（正常范围：150~1 100/μL）。腹部彩超：肝大，脾大，肠系膜多发肿大淋巴结；肺部CT：双肺炎症；骨髓细胞学（图 1）：骨髓增生明显活跃，粒红比值正常，全片有核细胞未见包涵体，可见吞噬细胞（吞噬粒细胞、有核红细胞和血小板）。患儿父母EB病毒IgM均阴性、IgG均阳性，EB病毒DNA均<5.0×10²/mL。

经家属知情同意，将患儿及其父母血标本送检至康圣环球医学特检集团，通过高通量测序（NGS）法，使用Life Technologies公司的Ion Proton测序仪检测家族性噬血细胞综合征（familial hemophagocytic lymphohistiocytosis，FHL）10个相关基因，PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2、XIAP、SH2D1A、Rab27a、AP3B1、LYST、ITK，使用DNAstar 软件包中的 Seqman 进行测序基因与正常LYST基因的比对分析。

结果：患儿及其父亲LYST基因有一处杂合突变：第46号外显子10 526位G→A，导致编码的3509位精氨酸被谷氨酰胺代替（Arg→Gln，Arg3509Gln），为错义突变，患儿母亲第46号外显子测序未发现此突变（图 2）。经检索人类基因突变数据库和最新文献，位于第46号外显子的突变c.10526G>A（p.Arg3509Gln）为新突变，该突变在人群中发生率极低，排除其单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）。

治疗第20周再次入院时，通过流式细胞术检测外周血NK细胞和CTL细胞在刺激前后的细胞膜CD107a分子表达。与刺激前相比，刺激后CD107a分子在NK和CTL细胞膜上的表达增加，但增加幅度低于正常参考范围，表明患儿NK和CTL细胞脱颗粒功能存在异常（见表 1）。

治疗与演变：患儿发热20 d，伴有脾大、血细胞三系减少、FIB明显减少、TG 升高、血清铁蛋白显著增高，以及骨髓涂片发现噬血细胞，符合噬血细胞综合征诊断标准^[1]，按2004-HLH方案（地塞米松、环孢霉素、依托泊苷）^[1]规律化疗，辅以抗感染、粒细胞集落刺激因子、成分输血等支持治疗，治疗第2周体温、血常规基本正常，肝功能、TG、FIB、铁蛋白等提示已缓解；治疗第5周，患儿再度出现持续高热，复查血常规、肝功能、血脂、凝血功能等提示复发（见表 2~3），家族性噬血细胞综合征相关基因测序结果提示患儿及其父亲的LYST基因存在杂合突变，诊断原发性噬血细胞综合征，建议干细胞移植，家属拒绝，继续原方案化疗，病情缓解，第6周出院，出院后予以维持治疗，第 9周复查HLH指标稳定；第20周患儿再次出现持续高热，血常规、肝功能、血脂、凝血功能、铁蛋白等提示HLH复发，行细胞毒脱颗粒检测（CD107a激发实验），显示：ΔNK-CD107a为3.72%，CTL细胞ΔMFI为1.5，考虑原发性噬血细胞综合征复发，再次建议行干细胞移植，目前等待移植中。

讨论：原发性噬血细胞综合征（primary hemophago-cytic syndrome，pHPS），又称原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（primary hemophagocytic lymphohistiocytosis，pHLH），是由多种因素导致机体免疫功能紊乱，引起单核/巨噬细胞系统反应性增生、大量细胞因子释放、导致多脏器浸润及全血细胞减少为特征的疾病^[2]。它是一种常染色体或X连锁隐性遗传病，包括FHL和原发性免疫缺陷病相关噬血细胞综合征（immunodeficiency related hemophagocytic lympho-histiocytosis，iHLH）^[3]。FHL有5个亚型，FHL1~FHL5。iHLH包括 Chediak-Higashi 综合征1 型、Griscelli 综合征2 型、Hermansky-Pudlak 综合征Ⅱ型和X-连锁淋巴增殖综合征（XLP，包括XLP-1 和XLP-2）等^[3]。pHLH相关的基因缺陷包括PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2、XIAP、SH2D1A、Rab27a、AP3B1和LYST^[4]。越来越多研究提示，即使基因检测为杂合突变，在一定条件下仍可诊断pHLH^[5]。pHLH在亚洲地区发病率较高，可达3.42/100万，男性：女性为1 : 1^[6]。90％的患儿发病年龄小于2岁，少数可延迟至青春期甚至成年后发病^[7]；而迟发性pHLH特别是年长儿和成人发病者逐渐增多，目前报道的pHLH最大发病年龄为62岁^[8]。

溶酶体运输调节因子基因（lysosomal trafficking regulator gene，LYST），定位于常染色lq42.1-42.2，全长205 878 kb，含52个内含子、53个外显子，编码LYST^[9]。 LYST含3 801个氨基酸，参与溶酶体形成和细胞内运输过程。LYST基因突变位点散布于大的编码区内，突变点约50 多个，多为无义突变、错义突变和框移突变，如c.11362 G>A（p.G3725R）、c.961 T>C（p.C258R）和c.925C>T（p.R309X ）^{[9, 10, 11]}。LYST 基因突变位点也可位于内含子，如c.7060-1 G>A，NM_000081^[12]。LYST基因突变导致细胞毒性颗粒不能正常释放，积聚成大的颗粒，致使CTL和NK细胞不能有效清除被感染细胞；巨噬细胞被活化的T 细胞刺激，分泌过量细胞因子，使T细胞及巨噬细胞处于失控的活化状态，继而表现出HLH的一系列症状。

本研究通过NGS发现患儿及其父亲LYST基因有一处杂合突变，而且CD107a激发实验阳性，支持pHLH的诊断。溶酶体相关膜蛋白-1（LAMP-1 或CD107a）是一种高糖基化蛋白，约占溶酶体膜蛋白的50%，当NK 细胞杀伤靶细胞时，细胞毒颗粒将到达浆膜面并与细胞膜融合，引起颗粒内容物释放，最终杀死靶细胞。随着脱颗粒的发生，CD107a 分子被转运至膜表面，并且CD107a 分子的表达上调与穿孔素的分泌一致^[13]，因此，CD107a 表达率可以反映NK 细胞杀伤活性。有学者^[14]提出，流式细胞术检测穿孔素或者CD107a激发试验对于静息状态下NK细胞和/或CTL细胞功能的反映具有一致性。Bryceson等^[15]对可疑HLH患者进行CD107a激发实验前瞻性队列研究，发现静息状态下NK细胞CD107a低于5%对于FHL诊断的敏感性为96%、特异性为88%。近年来研究提示，即使基因检测阴性或为杂合突变，在一定条件下仍可诊断为pHLH。Spessott等^[5]曾报道存在STXBP2基因杂合突变的患儿，因其相关蛋白munc18-2受影响而干扰溶酶体颗粒释放，最终诊断为FHL5；周晓姮^[16]研究中有2例患儿，1例PRF1基因存在杂合错义突变V50L，1例PRF1基因存在杂合错义突变R489W，综合穿孔素或颗粒酶B表达异常，明确诊断为FHL2。

本研究患儿及其父亲的LYST基因均出现同一杂合突变，但患儿发病、父亲无症状，推测有以下原因：（1）本研究患儿的CD107a明显降低，但因条件所限未完善患儿父亲的CD107a以及LYST蛋白检测，患儿父亲目前处于无病状态，不排除其CD107a和LYST蛋白均正常的可能。（2） pHLH是常染色体或X连锁隐性遗传病，但单纯的基因缺陷有时并不能够导致疾病的发生，往往由继发因素包括感染、免疫缺陷病、肿瘤及组织损伤等诱发，在儿童时期多为细菌或病毒感染诱发，而成人常为感染、恶性淋巴瘤及免疫性疾病等诱发。本研究患儿存在EB病毒感染，而患儿父亲无诱发因素。（3）目前发现的pHLH相关基因有PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2、XIAP、SH2D1A、Rab27a、AP3B1和LYST，但辛辛那提儿童医疗中心诊断的HLH患儿有一半以上不能用这些基因缺陷解释^[17]，提示将近一半的pHLH相关基因未被克隆出来，因此不能排除该患儿尚存在某些未被检测到的致病基因。（4）某些不典型突变所处区域编码的分子功能并不很重要，一般处于沉默状态，虽然可以导致NK 细胞和CTL功能障碍，但无典型的HLH临床表现，称为温和突变，这可能是部分pHLH发病延迟的原因^[18]。患儿父亲长期处于无病状态，不排除该突变位点为温和突变的可能性。pHLH相关的基因突变及其对特定蛋白质的作用仍需进一步研究。

综上，pHLH诊断困难，可通过基因检测确诊，但基因检测阴性或仅为杂合突变时，需要结合临床特征、相关基因的蛋白表达以及CD107a激发实验。深入地研究pHLH相关基因突变及其与特定蛋白质的相互作用，了解基因突变如何导致CTL和NK细胞功能障碍、建立pHLH快速诊断方法是今后努力的方向。