关节挛缩、肾功能不全和胆汁淤积（arthrogryposis, renal dysfunction, and cholestasis, ARC）综合征是一种常染色体隐性遗传病，以关节挛缩、肾功能不全和胆汁淤积为主要表现，部分患者存在鱼鳞癣、血小板形态和功能异常及继发性感染等其它表现；涉及到多个系统，预后不良，绝大部分患者存活不到1年^[1-2]。该病在1973年首次被报道，患者为一对近亲结婚夫妻的子代^[3]。经过40多年研究，目前已知VPS33B和VIPAS39基因突变均可导致ARC综合征，而国外文献报道的以上两个基因的突变类型达到299种及34种^[1]。2014年，国内曾报道2例ARC综合征患儿^[4-5]，但迄今有关本病的中文文献仅有会议摘要和综述各1篇^[6-7]。因此，从总体上讲，ARC综合征的诊断和治疗经验仍有待积累。本研究报道1例经基因分析确诊的ARC综合征，为后续研究提供参考。

1 资料与方法 1.1 研究对象

患儿，女，47 d，因皮肤巩膜黄染45 d、肝功异常39 d入院。患儿生后第3天出现皮肤巩膜黄染，并进行性加重，伴大便淡黄色，尿色深。生后第8天在当地医院查肝功能（表 1）：总胆红素（Tbil）、结合胆红素（Dbil）、非结合胆红素（Ibil）均增高，以非结合胆红素增高为主，余项正常，予熊去氧胆酸等治疗，但皮肤及巩膜黄染仍持续不退。于生后1个月行腹部彩超：胆囊内壁稍毛糙。至生后40余天，多次肝功能检查（表 1）发现Tbil、Dbil、总胆汁酸（TBA）仍明显升高，丙氨酸氨基转移酶（ALT）及门冬氨酸氨基转移酶（AST）轻度升高，GGT大致正常；尿常规：尿红细胞++++，白细胞+，尿蛋白+，尿胆红素++，尿糖+/-，尿比重1.005；粪便常规、凝血功能无异常，弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗体以及甲肝病毒抗体测定均阴性；头颅MRI未见明显异常。诊断考虑胆汁淤积症，继续予熊去氧胆酸利胆、维生素E抗氧化等治疗10余天，黄疸及肝功能异常等无明显改善，为明确病因收入院。患儿自起病以来，精神、食欲差，大便浅黄，小便深黄。

患儿系第一胎第一产，出生胎龄40周，顺产出生，出生体重3 300 g，身长50 cm。出生时无窒息史。父母体健，非近亲结婚，否认遗传病家族史。

入院体查：体重3.1 kg（ < -2 SD），身长48 cm（ < -2 SD），头围35.5 cm（ < -2 SD）。精神萎靡。全身皮肤黄染且干燥，伴四肢和躯干部脱皮，未见肝掌及蜘蛛痣，皮下脂肪消失。前囟平软、1.5 cm×2.0 cm。巩膜明显黄染，双侧瞳孔等大等圆、直径2.5 mm，对光反射灵敏。双肺呼吸音清晰，未闻及干湿啰音。心音有力，心率125次/min，各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音。腹部膨隆，肝右肋下2 cm，质软，边缘锐利，脾左肋下未及。双侧髋关节及膝关节屈曲，伸展受限。四肢肌张力低，腹壁和膝腱反射可引出，克、布氏征均阴性。

辅助检查：血常规白细胞14.35×10⁹/L（参考值11~12×10⁹/L），嗜中性粒细胞23.2%、淋巴细胞61.4%，红细胞2.23×10¹²/L（参考值4.0~4.3×10¹²/L），血红蛋白67 g/L（参考值110~120 g/L），余项正常。生化检查（表 1）示ALT及AST轻度升高，Tbil、Dbil、TBA升高明显，但GGT及胆固醇水平正常，ALB及25-羟基维生素D减低。

1.2 二代测序技术分析代谢性肝病相关基因

本研究经暨南大学附属第一医院医学伦理委员会批准，并获得患儿父母知情同意。取患儿静脉血2 mL（EDTA抗凝），按照Blood DNA Mini kit试剂盒（Simgen公司，中国）说明书提取基因组DNA，建立含有与代谢性肝病相关基因（ACADVL、B4GALT1、C10orf2、DBT、EARS2、FADD、SLC25A13、VIPAS39及VPS33B等共233个基因）的基因组文库。上述目标基因均用液相捕获试剂盒（迈基诺公司，中国）捕获，通过新一代测序（next generation sequencing，NGS）仪IlluminaHiSeq2000（Illumina公司，美国）完成高通量测序，测序平均深度不小于200。根据所得数据，进行基因序列生物信息学分析，找出致病基因突变。

1.3 Sanger测序验证突变

根据二代测序检测所得结果，对患儿及其父母DNA标本进行VPS33B突变基因Sanger测序分析。所用引物核苷酸序列（5'→3'）为：上游引物GGACTCACTGGAAGCCTTGTC，下游引物GAAATGTGACAGTCTGGCTGC。根据VPS33B基因序列使用PrimerPremier5.0软件进行引物设计（北京迈基诺基因科技股份有限公司合成）。聚合酶链反应体系为：2×Goldstar Buffer Mix 10 μL，上游引物和下游引物各1.5 μL，DNA 1 μL，灭菌双蒸水6 μL，共20 μL。反应条件为：95℃预变性10 min；随后分为3步，第一步94℃变性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸45 s，共反应3个循环；第二步94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸45 s，共反应5个循环；第三步94℃变性30s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共反应25个循环；最后再72℃延伸5 min。聚合酶链反应产物经琼脂糖凝胶电泳切胶纯化，纯化后的PCR产物送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。应用Chromas软件对测序结果进行分析，并应用DNAMAN软件与基因组VPS33B参考序列进行比对（Ensemble Genome Browser: ENSG00000184056）。

2 结果 2.1 遗传学分析结果

NGS分析代谢性肝病相关基因未发现进行性家族性肝内胆汁淤积症1型（ATP8B1基因）、原发性胆汁酸合成或结合缺陷（HSD3B7、SLC27A5和CYP7B1等基因）等GGT水平正常的遗传性胆汁淤积性肝病致病基因的任何突变，亦未发现胆汁淤积性肝病常见病因Citrin缺陷病相关基因SLC25A13的致病性突变^[8]。但患儿的VPS33B基因检测到1个纯合突变（图 1），该突变是位于外显子21的无义突变c.1594C > T（p.R532X）。经Sanger测序验证，确认该患儿为该突变的纯合子，而其父母均为携带者，见图 2。

2.2 诊治经过与结局

入院后更换无乳糖强化中链脂肪酸奶粉喂养，予熊去氧胆酸、还原型谷胱甘肽利胆护肝，输注浓缩红细胞纠正贫血，补充维生素D和钙剂，以及抗感染（入院后出现反复低热）等对症治疗，治疗13 d后，皮肤黄染稍有减轻、感染控制，家属要求出院。出院2个月后因病情进行性加重死亡。

3 讨论

近年来NGS以其高通量、成本低及敏感性高等优点，临床应用逐渐广泛。尤其对于临床表现相似但遗传学病因不同的遗传性疾病，靶向Panel高通量测序成本更低、覆盖面较广且数据分析速度更快，在遗传学病因识别方面具有良好的应用前景^[9]。本例患儿胆汁淤积表现典型，借助NGS分析技术，发现该患儿为VPS33B无义突变纯合子，经Sanger测序验证，其父母均为该突变基因携带者，最终确诊ARC综合征。

VPS33B基因位于染色体15q26.1，全长23.9 kb，包含23个外显子，编码的VPS33B蛋白主要参与细胞内蛋白的运输^[10-11]。可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体复合物（soluble NSF attachment protein receptors, SNAREs）是由4个SNARE蛋白组成的复合体，其中3个SNARE蛋白主要锚定在靶膜上，如内质网、细胞膜；而第4个SNARE蛋白主要锚定在囊泡上，不同蛋白相互识别及连接，促使囊泡与靶膜靠近，在囊泡融合中起核心作用^{[10, 12-14]}。VPS33B蛋白主要表达于胞质，通过其Sec1-样球形结构域与SNAREs结合，介导囊泡与细胞器膜及细胞膜之间的锚定、融合等过程，从而影响囊泡的转运功能，在细胞吞吐过程中发挥重要作用^{[10-11, 13-15]}。VPS33B基因在胎儿及成人的骨骼、肾脏、肝脏及皮肤等均有表达，因此ARC综合征患者的运动单位、肾小管、肝小叶及上皮细胞等结构和功能均受损，出现关节挛缩、氨基酸尿和糖尿、胆汁淤积及鱼鳞癣等多系统受累表现^{[10-11, 15-16]}。本文患儿主要表现为胆汁淤积性黄疸，双下肢髋关节及膝关节伸展受限，并伴四肢、躯干部片状脱屑、肾小管功能受损（氨基酸尿伴糖尿），符合ARC综合征的临床特点。

VPS33B蛋白的Sec1-样结构域由第31~611位氨基酸构成，可与SNAREs紧密结合，参与囊泡与细胞器及细胞膜之间的锚定^{[10-11, 13, 17-18]}。本例患儿的VPS33B基因突变是国外文献已报道的致病性突变类型，可导致VPS33B蛋白第532位编码精氨酸的密码子改变为终止密码子，使翻译提前终止，蛋白截短，Sec1-样结构域的完整性受到影响，从而影响到细胞内囊泡运输及细胞膜的融合，最终出现典型ARC表现^[10]。

本例患儿多次生化检查示ALT及AST轻度升高，Tbil、Dbil、TBA升高明显，但GGT正常。生理状态下，GGT在肝细胞内合成，通过糖化磷脂酰肌醇锚定于肝脏胆小管膜的管腔侧，并依靠胆汁中胆汁酸盐的洗刷作用从胆管细胞洗脱，作为胆汁成分之一排入肠腔^{[10, 19]}。而ARC综合征患儿，由于囊泡功能不全，胆汁分泌受阻，低浓度的胆汁酸盐对GGT的洗脱作用微弱，故患儿血浆GGT水平可正常^[19-20]。虽有文献^[5]报道ARC综合征的患儿可能存在高GGT水平，但目前认为，正常水平GGT可作为诊断ARC综合征的4个临床特点之一（关节挛缩、肾小管功能不全、胆汁淤积及正常水平GGT）^{[15, 21]}。

ARC综合征作为一种预后不良的常染色体隐性遗传病，绝大部分患儿因严重营养不良、反复感染、严重酸中毒、肝衰竭及凝血异常而死亡^{[15, 22-23]}。本文患儿诊治结局不良，符合这一特点。本病内科治疗效果虽有限，但熊去氧胆酸、还原型谷胱甘肽及利福平等可能轻微缓解胆汁淤积及瘙痒症状^[11]。针对部分患者的关节挛缩、髋关节脱位等畸形，手术矫正可恢复部分关节功能^[24]；但由于ARC综合征患儿免疫功能差及远期生存率低，除非严重病理性骨折或感染，不建议积极骨科手术治疗^[25]。Dehghani等^[26]报道1例进行了肝移植的ARC综合征患儿，随访5年，皮肤瘙痒及鱼鳞癣等症状明显改善，预后良好。但肝移植术后出血及感染的风险极大，疗效存在争议。

综上所述，本研究系统总结了1例经基因分析确诊的ARC综合征患儿的临床特点及遗传学特征，对于今后本病的分子诊断、临床管理及遗传咨询具有一定参考价值。