非酮性高甘氨酸血症（nonketotic hyperglycinemia, NKH, OMIM #605899）是一组常染色体隐性遗传的代谢性疾病，又称甘氨酸脑病，发病率估计为1 : 76 000^[1]。本病是由甘氨酸裂解系统活性缺乏所致的甘氨酸代谢障碍，大量甘氨酸在尿液、血清和脑脊液沉积，并通过N甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体过度刺激引发神经损伤^[2]。甘氨酸裂解系统是4个组分构成的多酶复合物：P-蛋白（吡哆醛磷酸依赖性甘氨酸脱羧酶），H-蛋白（硫辛酸蛋白），T-蛋白（四氢叶酸依赖氨基甲基转移酶）和L-蛋白（脂酰胺脱氢酶），分别由GLDC、GCSH、AMT和GCSL基因编码。遗传学研究证实NKH主要为甘氨酸裂解系统的相关基因GLDC、GCSH或AMT突变所致，有少量研究认为也可由GLRX5、BOLA3、LIAS基因缺陷引起^[3]。NKH最常见的表型为新生儿NKH，表现为出生后嗜睡、肌张力低下、肌阵挛性癫癎发作、呼吸暂停，大部分1岁以内死亡。但该疾病也存在一系列表型变异，即非经典型NKH，表现为精神运动发育迟缓、癫癎发作、共济失调、舞蹈病、语言发育落后、行为问题和热诱发的肌张力低下、精神行为异常，血清和脑脊液甘氨酸浓度升高不如新生儿NKH明显^[4-5]。目前国内仅有两篇新生儿NKH报道^[6-7]，非经典型NKH未见报道。本研究报道一个家系中一对兄妹因GLDC复合杂合突变所致的非经典型NKH，并将相关突变转染到H293T细胞后进行蛋白表达和酶活性测定。

病例1，男，6岁8个月，反复抽搐5年余就诊。9月龄起抽搐反复发作，表现为双眼凝视、呼之不应、牙关紧闭、口周发绀、肢体强直抽动，持续2~3 min不等，有时表现为肢体触电样快速抖动，每天发作10余次。诊断考虑癫癎，予以丙戊酸钠治疗，3天后患儿出现意识不清、肌张力降低，改用卡马西平、左乙拉西坦、氯硝西泮联合治疗，半年后患儿抽搐频率减少为数月1次。目前患儿不能独坐、独走，不会说话, 不会笑，不会主动抓物。患儿系第一胎第一产，足月顺产出生，出生时无窒息史。父母体健，家族中否认类似病史。体格检查：体重14 kg，头围49 cm，发育落后，营养差，神志清，反应迟钝，心、肺、腹部查体无异常，四肢肌肉萎缩、肌力4级、肌张力增高，双膝腱、跟腱反射亢进，病理反射未引出，脑膜刺激征阴性。辅助检查：尿、便常规，肝肾功能、血氨、乳酸以及脑脊液常规、生化均正常，干血斑串联质谱法分析提示氨基酸和酰基肉碱正常，头颅磁共振正常，脑电图显示广泛性癎样放电。

病例2，女，3岁5个月，病例1的妹妹。因精神行为异常、行走不稳1年余就诊。2岁时“急性上呼吸道感染”后出现烦躁不安、攻击行为、共济失调步态、四肢舞蹈样动作，以及发作性双眼斜视、上肢舞动。经抗感染及对症治疗后，患儿体温恢复正常，精神、行为异常好转。3岁1个月“急性上呼吸道感染”后再次出现烦躁不安、攻击行为，对症治疗后好转。目前患儿能独立行走，但步态不协调，可以理解简单语句，只能叫“爸爸、妈妈”。患儿系第二胎、第二产，足月顺产出生；3个月抬头，6个月独坐，17个月独立行走，3岁会叫“爸爸、妈妈”。体格检查：体重13.5 kg，头围49 cm，发育落后，营养中等，神志清，反应可，心、肺、腹部查体无异常，四肢肌力正常、肌张力偏低，直线行走不能，双膝腱、跟腱反射正常，病理反射未引出，脑膜刺激征阴性。辅助检查：血常规示淋巴细胞比例升高、余项正常；咽拭子副流感病毒阳性；血氨、血乳酸正常，尿粪常规、肝肾功能、脑脊液常规、生化均正常；干血斑串联质谱法分析提示氨基酸和酰基肉碱正常；头颅和胸腰髓磁共振正常；肌电图正常；心电图：窦性心律、室性早搏；动态心电图：窦性心动过速，频发室早，夜间出现一次2.4s的全心停搏；心脏彩超示三尖瓣轻度反流；脑电图显示广泛性、间断性、节律性δ活动。

取病例1外周血5 mL（EDTA抗凝），选择癫癎相关308个基因进行高通量测序（北京迈基诺公司），测序数据予以RTA软件（real-time analysis, Illumina）分析，CASAVAv1.8.2（Illumina）、BWA、GAT软件评估测序质量，获得单核苷酸变异（SNV）报告。再使用ANNOVAR、SIFT、PolyPhen-2.2.2、HGMD数据库、dbSNP数据库和1000基因组数据库进行变异注释和分析，以确认候选病原突变检测结果。对患儿突变区域进行Sanger测序验证，确定致病位点。并采集病例2及其父母的外周血5 mL（EDTA抗凝）进行Sanger测序验证。

本研究获得患儿父母知情同意。

采集病例1血液、尿液、脑脊液各5 mL，及病例2的血液、脑脊液5 mL（尿液标本未能收集到），使用日立全自动氨基酸分析仪L8900及液相色谱法检测甘氨酸浓度（由杭州博圣生物技术公司检测）。

培养H293T细胞，分别转染pMCV、pMCV-GLDC，以及S419X突变或C1002W突变的pMCV-GLDC质粒，48 h后收集细胞、提取蛋白。30 μg蛋白上样，先恒压80V电泳至溴酚蓝指示剂在浓缩胶与分离胶交界处成线状，改为恒压120V至溴酚兰到凝胶底部。转膜、封闭，GLDC兔多抗（英国Abcam）4℃过夜，鼠抗兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）室温2 h反应后显影。上述实验重复3次。

采用ELISA试剂盒（上海酶联生物）检测GLDC酶活性，取0.1 mL细胞上清液于反应孔中，按照试剂盒说明书进行操作，用酶标仪测定每孔在450 nm处的OD值。实验重复3次，每次检测3个复孔。

2例患儿在GLDC基因均发现突变：c.3006C > G（p.Cys1002Trp）和c.1256C > G（p.Ser419STer），均为新发突变，其中突变c.3006C > G（p.Cys1002Trp）来自母亲，突变c.1256C > G（p.Ser419STer）来自父亲，见图 1。查询致病数据库（OMIM、HGMD、Clinvar等），p.Ser419STer为无义突变，419位的丝氨酸变为终止密码子，蛋白合成提前终止，具有高致病性。p.Cys1002Trp为错义突变，PolyPhen2.2.2预测评分为1、SIFT评分为0，提示有致病性。在线生物信息软件Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）查询提示c.3006C > G（p.Cys1002Trp）在不同物种间高度保守；c.1256C > G（p.Ser419STer）在不同物种间保守度为4/7，但该突变造成蛋白合成提前终止。

图 1 患儿GLDC基因测序结果及其家系验证 病例1、2检测到GLDC基因c.3006C > G（p.Cys1002Trp）和c.1256C > G（p.Ser419STer）复合杂合突变，父亲检测到GLDC基因c.1256C > G突变，母亲检测到GLDC基因c.3006C > G突变，突变位点如箭头所示。

病例1的尿液甘氨酸浓度与肌酐的比值为1 154 μmol/mmol（参考值：64~236 μmol/mmol），血清甘氨酸浓度为751 μmol/L（参考值：0~276 μmol/L），脑脊液甘氨酸为45.3 μmol/L（参考值：1.6~19.5 μmol/L），脑脊液/血清甘氨酸之比为0.06（参考值：≤0.02）。病例2的血清甘氨酸浓度正常，脑脊液甘氨酸浓度增高（36.7 μmol/L），脑脊液/血清甘氨酸之比增高（0.13）。

与空白对照和空载对照相比，突变一组（S419X突变）和突变二组（C1002W突变）的GLDC蛋白表达增高，酶活性降低；与pMCV-GLDC对照组相比，突变一组、突变二组的GLDC蛋白表达无明显变化，GLDC酶活性下降（P < 0.01），但突变一组和突变二组GLDC酶活性的差异无统计学意义（P > 0.05），见图 2、3。

图 2 GLDC蛋白的检测 突变一和突变二的GLDC蛋白表达高于空白对照和空载对照；与pMCV-GLDC对照相比，无明显变化。

图 3 GLDC酶活性的ELISA测定 a示与空白对照组及空载对照相比，P < 0.01；b示与pMCV-GLDC对照相比，P < 0.01。

根据发病年龄NKH可分为新生儿型、婴儿型和迟发型。经典型NKH即新生儿型NKH，非经典型NKH包括婴儿型NKH、迟发型NKH和具有较好精神运动发育的新生儿型NKH^[5]。非经典型NKH可因症状不典型，血清和脑脊液甘氨酸浓度升高不显著导致诊治延误^[8]。Brenton等^[4]提到尿甘氨酸浓度与肌酐的比值增高对于晚发型NKH的诊断非常重要。本研究病例1的尿甘氨酸/肌酐比值明显升高，与文献相符，遗憾的是未获得其妹妹的尿液样本。Ezgu等^[9]在一个4月龄的顽固性癫癎患儿使用第二代高通量测序寻找病因，诊断速度早于其他方法。本研究2例患者均非新生儿期起病，脑脊液/血清甘氨酸之比均增高，最终通过目标基因捕获高通量测序确诊为非经典型NKH。

578个已报道的经典型NKH家系中，遗传分析确定了410个相关突变，约80%的甘氨酸脑病由GLDC基因突变引起，错义突变占了GLDC突变类型的52%，15%的患者有减毒表型^[1]。晚发型NKH患儿中，大部分情况下甘氨酸裂解系统维持正常的功能，但感染可导致甘氨酸裂解系统活性进一步降低，引起共济失调、舞蹈病样动作、精神问题等非特异性脑病表现^[4]。本组2例患儿，父源c.1256C > G（p.S419X）无义突变导致第419氨基酸位置上丝氨酸突变为终止密码子，改变了蛋白结构，为致病突变；母源c.3006C > G（p.C1002W）错义突变，第1002氨基酸位置上半胱氨酸变为色氨酸，蛋白预测软件分析为致病突变。本研究兄妹基因型相同，而表型并不完全一样。Korman等^[10]报道GLDC基因A802V（c.2405C > T）突变的两个家系，两个家系的父母均为表型正常的基因携带者，家系A的三姐妹均为纯合突变，其中2人新生儿期出现NKH症状、1人无症状；家系B中3个含纯合突变的孩子均为严重的新生儿型NKH，2人死亡，1人遗留严重神经系统后遗症，进一步用A802V突变的GLDC基因转染COS7细胞，其甘氨酸脱羧酶活性降低至32%。Swanson等^[11]也发现含有相同GLDC复合杂合突变（p.A389V/p.R515S）的两个患儿具有较大差异的临床表型。基因型相同，而临床表型不同，可能与部分突变并未导致甘氨酸脱羧酶完全失活有关，而其他遗传或非致病因子对甘氨酸脱羧酶活性可能也有影响^[11]。本研究将两种突变的pMCV-GLDC转染到H293T细胞，其甘氨酸脱羧酶活性下调至野生型的39.9%和41.2%，与Korman等^[10]的报道类似。

目前，NKH的标准治疗策略包括采用苯甲酸钠降低脑内甘氨酸浓度，以及受体拮抗剂右美沙芬和氯胺酮阻断NMDA受体^[12-13]。Deutsch等^[14]认为右美沙芬治疗减少了癫癎发作，可以改善部分患者预后。Chien等^[15]则认为苯甲酸钠和右美沙芬联合对预后没有任何帮助。NKH的治疗效果与患儿体内甘氨酸脱羧酶失活程度相关。如果甘氨酸脱羧酶完全失活，即使从出生时就开始治疗，患儿仍可表现频繁的癫癎发作、智力运动发育落后和痉挛性瘫痪，甚至死亡^[16]；如果甘氨酸脱羧酶活性部分丧失，早期使用右美沙芬和苯甲酸钠治疗可改善预后^{[10, 17]}。丙戊酸盐是甘氨酸裂解系统抑制剂，可导致甘氨酸浓度增高，需慎用于NKH患者^[18]。本研究病例1发病初期短暂使用丙戊酸盐后病情加重可能与此有关。

总之，本研究在一个非经典型的NKH家系中发现2个新的GLDC基因突变（p.C1002W、p.S419X），体外质粒转染实验进一步证实了其致病性，本研究丰富了GLDC突变谱，为研究中国人群GLDC突变类型、遗传方式提供了一定的参考。