家族性男性性早熟（familial male-limited precocious puberty, FMPP）又称家族性高睾酮血症，在1981年由Schedewie等^[1]首次报道，属于常染色体控制的非促性腺激素依耐性的性限制性遗传病，是外周性性早熟的一种罕见疾病。1993年Shenker等^[2]首次从8个家族的多名FMPP患者中检测到LHCGR基因突变（D578G），提示该疾病可能是由编码黄体生成激素/绒毛膜促性腺激素受体（LHCGR）基因突变导致的。后续的功能试验表明，表达该突变的COS-7细胞在无激动剂存在的情况下，腺苷酸环化酶（cAMP）的合成显著增加，提示该病患者睾丸Leydig细胞的自发活性来源于LH受体的自发性持续性激活^[2]，导致FMPP的发生。目前已知引起FMPP的LHCGR突变类型共18种，2016年5月我院收治了1名FMPP患者，本文旨在汇报该患儿的临床特点和分子诊断结果，为本病诊治研究提供参考，具体信息如下：

1 资料与方法 1.1 研究对象

患儿，男，10个月9 d，因发现阴茎增长过快4个月来我院就诊。患儿近4个月出现阴茎增长过快，伴每日阴茎勃起数次，并出现阴毛，生长速度较同龄儿明显偏快。无变声，无痤疮，无体味、体毛增多。患儿系第1胎第1产，足月顺产，出生体重3.1 kg，身高51 cm。否认特殊接触及药物应用史。母孕期体检未见异常，父亲身高163 cm，母亲身高160 cm，遗传靶身高168 cm（-0.77 SD），父母非近亲婚配，家族中其他成员无类似病史。体查：身高80.3 cm（+2.42 SD），体重12.0 kg，性征：乳房TannerⅠ期，外生殖器发育Tanner分期G2期，阴茎6.0 cm×1.9 cm，可见阴毛，无腋毛、胡须、痤疮，皮肤无咖啡斑，余体查未见特殊情况。

1.2 辅助检查

血常规、尿常规、肝功能、肾功能、电解质、血脂检查结果均未见异常。甲胎蛋白、癌胚抗原阴性。激素水平检查结果见表 1。阴囊B超提示：左侧睾丸大小15 mm×6.5 mm，右侧睾丸大小15 mm×7 mm，双侧睾丸体积较同龄儿偏大。肾上腺B超提示：左侧肾上腺厚度4.5 mm，右侧肾上腺厚度4.6 mm，双侧肾上腺未见包块回声。垂体核磁共振未见异常。左手及腕部正位片提示：骨龄为3岁。

1.3 基因检测

在父母知情同意的情况下，采集患儿及其父母外周静脉血各2 mL于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中。采用QIAamp DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）抽提基因组DNA，并测量其吸光度值及浓度。提取的DNA用DNA酶片段化后用磁珠法进行纯化，随后进行PCR扩增并连接上接头序列，经TruSight One Sequencing Panel（美国Illumina公司）两次捕获及纯化，再经PCR扩增和纯化后获得的最终文库在MiSeq测序仪（美国Illumina公司）上对20个性早熟相关的基因进行检测，具体包括：CDKL5、CYP11B1、CYP17A1、CYP19A1、CYP21A2、ESR1、FSHR、GNAS、HSD3B2、IGF1、KDM6A、KISS1、KISS1R、KMT2D、LHCGR、MKRN3、POR、SHBG、STAR、STK11，对上述基因的外显子编码区进行直接测序，并与参考序列进行比对，从而发现可能存在的基因突变。

1.4 Sanger测序验证

对可疑候选突变的位点设计PCR引物进行扩增及Sanger测序验证，并对患儿父母相应位点进行检测。

1.5 LHCGR变异的保守性分析

不同物种LHCGR同源蛋白序列从NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库下载，应用在线软件Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）比对分析多物种LHCGR蛋白的氨基酸序列，以评估被改变氨基酸在进化上的保守性。

1.6 LHCGR变异的致病性分析

对于所发现的LHCGR基因变异，应用在线软件PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、PROVEAN（provean.jcvi.org/index.php）和MutationTaster（http://mutationtaster.org/MutationTaster/index.html）进行预测，分析其致病性。

1.7 突变蛋白结构预测分析

LHCGR蛋白的结构模型使用在线软件SWISSMODEL构建（http://swissmodel.expasy.org），并采用SWISS-PdbViewer 4.1.0（http://www.Expasy.org/spdbv/）对突变的蛋白结构进行预测。

2 结果 2.1 临床分析结果

患儿具有典型的临床症状和体征，血清睾酮明显升高，而血清促性腺激素水平仍处于低水平；GnRH激发实验结果提示该患儿LH峰值出现在30 min，为0.42 mIU/mL，LH/FSH最大值为0.26，GnRH激发试验阴性，符合外周性性早熟的诊断标准。见表 1。

2.2 遗传学分析结果

通过对患儿外周血DNA中的20个性早熟相关基因进行检测，发现患儿LHCGR基因的11号外显子存在杂合突变c.1732G>C，导致第578位密码子编码的氨基酸由天冬氨酸（Asp）变为组氨酸（His），可能导致编码产物结构改变，使LHCGR持续激活。余基因未见明显异常。研究中我们检索了人类基因突变数据库“The Human Gene Mutation Database at the Institute of Medical Genetics in Cardiff”（http://www.hgmd.cf.ac.uk）以及PubMed（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/），证实该突变在之前未被报道过，为一新突变。患儿父亲及母亲均为野生型。结合父母基因检测结果推测先证者1732位碱基突变为新发突变。见图 1。

2.3 突变氨基酸在物种进化上的保守性

将人LHCGR蛋白的氨基酸序列与猪、牛、羊、家鼠、沟鼠、鸡、斑马鱼的蛋白序列进行比对，结果显示LHCGR蛋白第578位氨基酸在物种进化上完全保守，结果如图 2。

2.4 LHCGR新突变致病性分析

LHCGR蛋白p.D578H突变，经Mutation Taster软件预测为致病性突变，预测正确的概率值为0.999。经PROVEAN软件分析，在截点值分数为-2.5的标准下，该突变位点的分数为-5.943，提示为致病性突变。同时，PolyPhen-2软件预测p.D578H为致病性突变，预测正确的概率值为1.0（预测的敏感性为0，特异性为1.0）。以上3种生物信息学分析软件均提示p.D578H突变可能为致病性突变。

2.5 LHCGR蛋白结构预测

进行蛋白结构预测时，用SWISS-MODEL在线检索LHCGR蛋白的模板，未出现相应LHCGR的蛋白模板，因而p.D578野生型选取的蛋白结构模型为人腺苷酸受体A2a和可溶性细胞色素b562（5mzj.1A），序列一致性为20.79%。采用SWISS-PdbViewer 4.1.0软件将p.D578野生型模型的第578位氨基酸由天冬氨酸变成组氨酸，并比对两者构象的差异，发现第578位氨基酸突变后，可与周围氨基酸形成新的β折叠，蛋白空间结构发生变化。见图 3。

2.6 治疗与结局

家长签署知情同意书后，给予患儿口服第三代芳香化酶抑制剂来曲唑联合螺内酯治疗。用药半年后，患儿阴茎增长及生长速率得到明显控制，未再有阴茎勃起，骨龄增加0.6岁。未见明显的药物不良反应。

3 讨论

在本研究中，检测了1位患有外周性性早熟的10个月大男婴的性早熟相关基因，结果提示，其LHCGR基因的11号外显子发生了杂合突变（c.1732G>C），导致第578位密码子编码的氨基酸由天冬氨酸变为组氨酸。该突变在之前未被报道过，为一新突变。

LHCGR基因位于染色体2p21，基因全长70 kb，包括11个外显子和10个内含子，其编码的蛋白是具有7个跨膜片段的G蛋白配体受体大家族的成员。研究发现LHCGR基因的突变可以是激活性的（可致男童FMPP），也可以是失活性的（可致男性性分化障碍或女性无排卵）。1993年Shenker等^[2]和Kremer等^[3]分别报道了LHCGR基因突变与FMPP的联系。迄今为止，所有已知的LHCGR基因的激活性突变都是由单个碱基替换造成的错义突变，共18种，具体包括L368P、A373V、M398T、L457R、I542L、D564G、D564V、A568V、M571I、A572V、I575L、T577I、D578Y、D578G、D578E、D578A、C581R及C617Y^[4-5]。这些突变均位于第11外显子中，1624~1741位碱基被认为是LHCGR基因激活性点突变的热点突变区，即绝大部分突变发生在第5和第6个跨膜螺旋区或连接两者的胞浆环，编码571~581之间的氨基酸。其中最常见的突变是第6跨膜区的第578位的天冬氨酸被甘氨酸代替（D578G），该突变主要见于美国FMPP患者，占美国报道病例约90%^[6]。同时，中国报道的5例导致FMPP的基因突变类型中，4例为LHCGR基因M398T突变^[7-8]，另外1例为A568V突变^[9]，提示不同的人种LHCGR基因突变类型有明显差异。

人类的LHCGR属于G蛋白偶联受体家族成员，正常情况下，LH与睾丸Leydig细胞上的LH受体结合，激活cAMP，促使睾酮的合成增加。而FMPP患儿，LHCGR不需与配体LH结合，而呈持续性激活，导致细胞内的非LH依赖性的cAMP增加，Leydig细胞持续合成分泌睾酮。既往文献报道在男性性早熟患者中检测到LHCGR基因第578位由天冬氨酸突变的包括以下4种类型，p.D578Y、p.D578G、p.D578E、p.D578A突变。研究发现p.D578A突变，可导致基底细胞内cAMP增加3~5倍^{[2, 10]}。2010年Nagasaki等^[11]报道了一位6岁的FMPP患儿，基因检测发现其存在LHCGR基因的c.1850G>A（p.C617Y）突变；随后Nagasaki在COS-1细胞系中突变了LHCGR基因第1850位碱基，验证其功能，结果提示p.C617Y突变导致基底细胞内cAMP比野生型受体增加15%^[11]。结合点突变后cAMP升高程度与相应的临床症状分析，一般情况下，FMPP患者年龄在1~4岁之间发病，出现生长加速和骨骼进展。Nagasaki等^[11]报道的患儿在6岁时才逐渐出现相应的临床症状，且其病情发展并不迅速。而在本病例中，患儿从6个月大时就出现了明显的阴茎发育过快，伴生长加速及骨骼进展，且伴有出现阴茎勃起及阴毛，发病时间早，且疾病进展迅速。考虑这些临床表现可能反映了患者LHCGR突变体的独特特征，即不同突变位点导致LH受体持续激活的能力不同，导致疾病的发病早晚及严重程度不一致，578位氨基酸突变引起LH受体持续激活的能力较强。但关于LHCGR基因c.1732G>C（p.D578H）突变仍需进一步的功能验证，明确其激活LHCGR的能力。

本例具有典型的临床表现，6个月大时出现阴茎增粗及生长加速，阴茎6.0 cm×1.9 cm，短时间即出现阴茎勃起及阴毛，睾酮水平明显增高。10个月大时骨龄即加速至3岁，睾丸增大，但GnRH兴奋试验呈青春期前反应，可与中枢性性早熟相鉴别。除中枢性性早熟，外周性性早熟需与先天性肾上腺皮质增生症、McCune-Albright综合征、芳香化酶缺乏症、肿瘤相关的性早熟等疾病相鉴别，因而本课题组在临床上检测了孕酮、促肾上腺皮质激素、17-羟孕酮、雄烯二酮、硫酸脱氢表雄酮、皮质醇、甲胎蛋白、癌胚抗原，同时做了肾上腺B超及垂体MRI，结果均未见异常。在基因分析时，检测了相关致病基因，包括CDKL5、CYP11B1、CYP17A1、CYP19A1、CYP21A2、ESR1、FSHR、GNAS、HSD3B2、IGF1、KDM6A、KISS1、KISS1R、KMT2D、LHCGR、MKRN3、POR、SHBG、STAR、STK11，从基因上排除了上述基因突变导致疾病的可能性，最后通过基因分析，发现患儿LHCGR基因第11外显子发生了c.1732G>C（Asp578His）突变，最终确诊为FMPP。

FMPP患儿由于骨骺过早闭合而导致成年矮身材，治疗上主要是将体内雌激素抑制到青春期前水平，以达到抑制骨龄快速进展的目的。在家属签署知情同意书后，我们选择了第3代芳香化酶抑制剂来曲唑联合抗雄激素制剂螺内酯治疗。用药半年后随访，患儿阴茎增长及生长速率得到明显控制，未再有阴茎勃起，骨龄增加0.6岁，且未见明显的药物不良反应。除成年身高外，FMPP患者还可能会出现生育问题及肿瘤相关问题。在1998年Martin等^[12]报道了1例因LHCGR基因突变（p.D578G）发生FMPP的患儿，其在35岁时被诊断为睾丸精原细胞瘤。在本病例中，该患儿同样发生了LHCGR基因578位氨基酸的突变，因此该患儿的远期病情进展仍需进一步密切随访观察。

综上所述，本文通过基因检测发现FMPP患儿LHCGR基因发生c.1732G>C（Asp578His）突变，该突变在之前并未被报道过。该突变导致患儿发病早，病情进展迅速，LHCGR基因突变分析可为患者分子诊断、家系遗传咨询及产前诊断提供实验依据。联用第3代芳香化酶抑制剂和抗雄激素制剂可有效控制症状。