先天性纯红细胞再生障碍性贫血又称Diamond-Blackfan贫血（Diamond-Blackfan anemia, DBA）是一种少见的先天性骨髓衰竭性疾病，其血液学特点为巨幼红细胞性贫血，网织红细胞计数减少，骨髓粒系、巨核系细胞增生正常、红系细胞明显缺乏，因Diamond和Blackfan于1938年首先报道而得名^[1-2]。欧美国家DBA的发病率为5~7/100万，国内暂没有DBA发病率的统计^[3]。首先被证实与DBA发生有关的基因为编码核糖体小亚基蛋白19的RPS19基因，随后发现编码其他核糖体蛋白的基因，如RPL5、RPS17、RPS24、RPS7基因突变也可导致DBA发生^[4-5]。本文结合2例DBA患者并进行相关文献复习，总结该病的临床及基因特点，以提高临床医师的认识。

病例1，男，3个月。因面色苍黄近一个月入院，无皮肤黏膜出血，无发热、呕吐、抽搐，大小便正常。查体：T37.2℃，P132次/min，R36次/min，头颅五官无畸形，面色苍黄，全身皮肤无黄染、未见皮疹、无水肿。双肺未闻及罗音；心律齐，心音有力，心脏各听诊区均未闻及杂音；腹软，肝脾肋下未触及；脊柱四肢无畸形。实验室检查：白细胞及血小板数正常，Hb 37 g/L，RBC降至1.08×10¹²/L，红细胞压积（HCT）降至9.2%，网织红细胞计数4.1×10⁹/L（参考值：24~84×10⁹/L），红细胞平均体积、平均血红蛋白、平均血红蛋白浓度正常；血清铁42.1 mmol/L（参考值：14.3~26.9 mmol/L）、血清铁蛋白484.2 ng/mL（参考值：12~290 ng/mL）。红细胞脆性实验未见异常。骨髓细胞学显示：红系比例约2%、明显降低，幼红细胞罕见（早幼红细胞缺如，中幼红细胞约1.5%，晚幼红细胞约0.5%），粒系比例约为62%，淋巴细胞系比例约为26%，单核细胞比例约为4%，提示纯红细胞再生障碍贫血（pure red cell anemia, PRCA）可能性大。患儿既往无特殊，父母非近亲结婚，家族中均无类似病史。

病例2，女，2个月。面色苍黄20 d。不伴皮肤黏膜出血及发热、抽搐，偶有咳嗽和间断吐奶，大小便正常。查体：T36.9℃，P130次/min，R35次/min，贫血面容，神志清楚，全身皮肤未见皮疹，头颅五官无畸形，双侧呼吸运动对称，双肺未闻及罗音，心律齐，心音有力，各听诊区未闻及杂音，腹平软，肝脾未及。脊柱四肢无畸形。实验室检查：白细胞及血小板数目正常，Hb 41 g/L，RBC 1.35×10¹²/L，红细胞压积降至13.4%，网织红细胞计数4.3×10⁹/L（参考值：24~84×10⁹/L）；红细胞平均血红蛋白为38.4 pg（正常值：25~35 pg），红细胞平均体积、平均血红蛋白浓度正常；血清铁44.1 mmol/L（参考值：14.3~26.9 mmol/L），血清铁蛋白467.6 ng/mL（参考值：12~290 ng/mL）；骨髓细胞学：有核红细胞难以见到（红系缺如或比例极低），粒系细胞比例约为63%，淋巴细胞系比例约为29%，单核细胞比例约为5%。腹部彩超未见异常。患儿既往无特殊，父母非近亲结婚，家族中均无类似病史。

根据DBA诊断标准^[6]：（1）发生在出生后12个月以内的大细胞正色素性贫血，白细胞数正常或稍降低，血小板数正常或稍增加；（2）网织红细胞明显减少；（3）骨髓增生活跃，选择性红系前体细胞明显减少；（4）血清促红细胞生成素水平增高；（5）排除继发性单纯红细胞再生障碍性贫血。本研究2例患儿均符合第2、3条诊断标准，且无细小病毒B19感染依据，无苯妥英钠、氯霉素等用药史，DBA可能性大。

采集患者及家属的外周静脉血2 mL，提取基因组DNA。DBA致病基因RPS19及RPL5的引物由上海生工合成，引物序列见表 1。PCR反应体系及扩增程序：基因组DNA 50~100 ng，dNTP 200 μmol/L，MgCl₂ 1.5 mmol/L，上下游引物各0.5 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U（大连TAKARA公司），加水至终体积25 μL。94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55~60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后送上海生工生物公司进行Sanger测序分析。

表 1

表 1 RPS19基因以及RPL5基因的引物序列

表 1 RPS19基因以及RPL5基因的引物序列

本研究获得医院医学伦理学委员会批准及患者家属知情同意。

利用Polyphen2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、及SIFT（http://sift.jcvi.org/）软件对致病基因检测发现的新突变进行功能预测分析。并利用NCBI数据库进行不同物种间的保守序列分析。

利用RPS19基因及RPL5基因特异性引物扩增该基因全部外显子，并对PCR产物进行测序分析，发现：病例1的RPS19基因存在c.212G > A（p. G71Q）杂合突变（图 1），患儿父母在该位点均未见突变。病例2的RPL5基因存在c.740T > C（p.I247L）突变（图 1），其父母在该位点未见异常。

图 1 2例患儿的RPS19基因及RPL5基因测序 病例1的RPS19基因存在c.212G > A（p. G71Q）杂合突变，病例2的RPL5基因存在c.740T > C（p. I247L）突变。突变位点如箭头所示。

利用生物信息学的方法预测病例2 RPL5基因的c.740T > C（p. I247L）突变是否为致病性突变。Polyphen2软件预测分数为1.00（得分越接近1.00者，致病的可能性越大），SIFT软件预测的结果为0.00（得分 < 0.05可能影响蛋白质功能）。并在NCBI数据库中应用不同物种之间的保守序列分析发现，RPL5蛋白247位的异亮氨酸（c.740T > C突变导致编码的RPL5蛋白在247位由异亮氨酸变为亮氨酸）十分保守，见图 2，说明该位点突变对蛋白发挥正常功能具有重要影响。

图 2 RPL5蛋白247位氨基酸保守性分析 红色框内为该位点，在不同的物种间（家鼠、原鸡、果蝇、褐鼠、牛以及非洲爪蟾）均高度保守。

两例患儿入院后均予以红细胞输注，出院时患者1的Hb为93 g/L，患者2为88 g/L；出院后均口服甲泼尼龙片（每日一次，每次7.5 mg），并定期随访，目前已随访5个月。患者1出院1个月时Hb降至54 g/L，再次输注红细胞，之后Hb维持在82~92 g/L；患者2出院以后Hb维持在83~91 g/L。

DBA是一种少见的遗传性骨髓衰竭性疾病，但在儿童先天性骨髓衰竭性疾病中所占比例较高，仅次于范可尼贫血^[7]。一般在生后数月起病，男女发病比例大致相同，大部分为散发，约10%~25%的患者有家族史^[8]。

DBA的发病机制可能与红系祖细胞内在异常、红系造血调控异常以及核糖体相关蛋白的功能异常有关。DBA与核糖体蛋白的关系是DBA发病机制研究的热点，目前已将该疾病归类于核糖体病^[9-10]。有研究发现约25%的DBA患者有RPS19基因突变，2%的DBA存在RPS24基因突变，编码核糖体蛋白的RPS17基因、RPL5基因、RPL11基因以及RPL35a基因突变也可导致DBA发生^{[5, 11]}。

RPS19基因定位于19q13.2区域，全长11 kb，包括6个外显子，其编码的RPS19蛋白是首先被发现的与DBA发病相关的核糖体蛋白^[13]。RPS19蛋白非常保守，含有144个氨基酸，可能参与40S核糖体前体的组装和成熟，从而实现细胞内翻译、转运调控功能^[12]。RPL5基因位于1p22.1区域，其编码的蛋白是属于核糖体60S的一个亚单位，且该蛋白可结合5S rRNA形成RNP，维持核糖体的正常功能^[13]。

本研究中的2例患者均呈重度贫血，骨髓细胞学检测提示幼红细胞罕见，进行DBA相关致病基因检测，发现1例患儿的RPS19基因存在c.212G > A（p. G71Q）杂合突变，该突变为错义突变，导致编码的RPS19蛋白在71位由甘氨酸突变为谷氨酸。有报道该位点突变为致病性突变^[14]，但患儿父母的RPS19基因该位点未见异常，因此患儿可能为新发突变。另1例患儿的RPL5基因存在c.740T > C（p. I²47L）突变，此突变可导致编码的RPL5蛋白在247位由异亮氨酸转变为亮氨酸，检索NCBI数据库及千人基因数据库（1 000 genomes）发现该位点不是多态性位点，且DBA在该位点的突变未见报道；但根据生物信息学分析预测、不同物种间保守性分析以及患者的临床表现，推测该位点可能为致病性位点，但仍需要进一步细胞水平及动物实验的验证。

约1/3的DBA患者合并先天畸形，如发育迟缓、尿道畸形、先天性心脏病以及拇指三指节畸形等，且该类患儿易并患急性非淋巴细胞白血病及非造血系统肿瘤^[9]。有研究发现RPL5基因与RPL11基因的突变与DBA合并畸形相关，编码核糖体蛋白基因突变的DBA患儿畸形发生率大于40%，明显高于无突变患儿^[15]，但本文两例患者暂未发现明显畸形，不排除与患儿年龄尚小有关，应注意这方面的随访。

DBA主要采用糖皮质激素进行治疗。郑杰等^[8]研究显示，约60%~75%的DBA患者对糖皮质激素有反应，部分患儿能获得持续性缓解（29例接受激素治疗的DBA患儿中3例完全缓解）。其次为红细胞输注对症治疗，但长期输血有并发血色病的可能。有条件可行造血干细胞移植进行DBA根治性治疗，但干细胞来源以及移植相关并发症在一定程度限制了其临床应用^[8]。

综上，DBA多在半岁以内起病，表现为巨幼红细胞性贫血、红系明显减少，编码核糖体亚基蛋白的基因突变，因此应尽早进行相关致病基因检测以明确诊断。