手足口病（hand, foot and mouth disease, HFMD）好发于5岁以内的儿童，其中重症患儿发病急骤、进展迅速，主要致死和致后遗症的原因为中枢神经系统损害，引起神经源性肺水肿和急性迟缓性麻痹。中枢神经系统损害作为重症HFMD的始动因子，其早期识别及疾病严重程度的早期判断目前主要通过临床表现及血糖、心肌酶、白细胞总数、腰穿等检查判断^[1-4]，临床缺乏特异性及可操作性强的检测指标。近年来，脑损伤的神经生化标志物，如S100B蛋白、神经元特异性烯醇化酶（NSE）在脑损伤病理过程中的作用引起了人们极大的关注，与重症HFMD的关系也有许多报道^[5-6]。本研究对HFMD患儿进行血清S100B蛋白及NSE水平测定，旨在评价其对预测HFMD严重程度的价值。

选取2012年10月至2015年10月在我院诊断并治疗的90例HFMD患儿为研究对象。其临床诊断及分型均符合卫生部《手足口病诊疗指南2010年版》^[7]标准，分为普通型组、重型组、危重型组。均为初发病例，血标本采集前未接受过糖皮质激素等特殊治疗；均无癫癎、脑瘫等病史，既往均无运动、精神发育落后于同龄儿等情况，近期无手术、骨折或脑外伤史。

普通型组30例，其中男17例，女13例，平均年龄4.2±2.1岁；重型组30例，其中男17例，女13例，平均年龄3.6±1.8岁；危重型组30例，其中男16例，女14例，平均年龄3.3±1.7岁。另选取30例健康体检儿童为对照组，其中男17例，女13例，平均年龄3.8±1.6岁。4组性别构成及年龄比较差异无统计学意义（P > 0.05）。本研究经我院医学伦理委员会批准, 且受试者家属均知情同意。

所有患儿均于入院第1天及治疗后第7天（患儿进入恢复期，无发热等急性期表现）采集外周静脉血3 mL注入干净试管，室温凝固30 min，1 000 r/min离心15 min，收集血清，分装后-20℃冷冻保存备用。详细记录患儿的临床资料，包括姓名、性别、年龄、临床表现、治疗、住院时间等。实验室检查包括凝血常规、血常规、血生化检查等。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清S100B蛋白及NSE水平，ELISA试剂盒为上海恒远生物科技有限公司产品。

采用SPSS 19.0统计软件包对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，治疗前后S100B蛋白、NSE水平的比较采用配对t检验。依据S100B蛋白及NSE检测结果进行分析，确定测定值的上下限、组距以及截断点（cut-off point），按选择的组距间隔列出累积频数分布表，分别计算出所有截断点的敏感性、特异性和假阳性率（1-特异性）。以敏感性为纵坐标代表真阳性率，（1-特异性）为横坐标代表假阳性率，作图绘成受试者操作特征曲线（ROC曲线）。S100B蛋白及NSE检测结果对重症HFMD（包括重型和危重型HFMD）预测情况用ROC曲线下面积（AUC）衡量，在AUC > 0.5的情况下，AUC越接近1，则诊断效果越好：当AUC在0.5~0.7时，结果有较低的准确性；当AUC在0.7~0.9时，有一定准确性；当AUC在0.9以上时有较高的准确性。根据曲线确定诊断准确度最高（即Youden值最大）的临界值。P < 0.05为差异有统计学意义。

治疗前4组血清S100B蛋白和NSE水平见表 1。危重型组HFMD患儿血清S100B蛋白和NSE水平均较其他3组明显升高（P < 0.001）；重型组HFMD患儿血清S100B蛋白和NSE水平均较普通型组和对照组明显升高（P < 0.001）；普通型组HFMD患儿血清S100B蛋白和NSE水平与对照组比较差异无统计学意义（P=0.539）。

表 1

表 1 治疗前4组间血清S100B蛋白和NSE水平的比较（μg/L，x±s）

表 1 治疗前4组间血清S100B蛋白和NSE水平的比较（μg/L，x±s）

与治疗前比较，治疗后好转进入恢复期的重型组HFMD患儿血清S100B蛋白及NSE水平明显下降（分别t=15.41、24.94，P < 0.05）；治疗后好转进入恢复期的危重型组血清S100B蛋白及NSE水平亦明显下降（分别t=11.27、11.79，P < 0.05）。见表 2。

表 2

表 2 重症HFMD患儿治疗前后血清S100B蛋白和NSE水平的比较（μg/L，x±s）

表 2 重症HFMD患儿治疗前后血清S100B蛋白和NSE水平的比较（μg/L，x±s）

治疗后好转的危重型组HFMD患儿血清S100B蛋白水平与重型组比较差异无统计学意义（P=0.138），与对照组比较差异有统计学意义（P=0.001）；危重型组治疗后血清NSE水平与重型组、对照组比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。重型组治疗后血清S100B蛋白、NSE水平与对照组比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 3。

表 3

表 3 重症HFMD患儿治疗后血清S100B蛋白及NSE水平与对照组的比较（μg/L，x±s）

表 3 重症HFMD患儿治疗后血清S100B蛋白及NSE水平与对照组的比较（μg/L，x±s）

急性期重症HFMD患儿血清S100B蛋白和NSE水平均有不同程度的升高，分别以血清S100B蛋白、NSE水平作为预测指标来判断研究对象是否可诊断为重症HFMD。利用SPSS统计软件构建ROC曲线（图 1），结果显示：S100B蛋白的AUC为0.833，NSE的AUC为0.822，两者作为预测指标对判断重症HFMD的效果相当。入选患者血清S100B蛋白在0.445 μg/L时其Youden值最大，为0.611，其对重症HFMD预测的灵敏度为61%，特异度为100%（表 4）。血清NSE在5.905 μg/L时其Youden值最大，为0.533，其对重症HFMD预测的灵敏度为80%，特异度为73%（表 5）。

图 1 血清S100B蛋白和NSE水平对重症HFMD诊断的ROC曲线

表 4

表 4 血清S100B蛋白水平预测重症HFMD的灵敏度和特异度

表 4 血清S100B蛋白水平预测重症HFMD的灵敏度和特异度

表 5

表 5 血清NSE水平预测重症HFMD的灵敏度和特异度

表 5 血清NSE水平预测重症HFMD的灵敏度和特异度

根据上述得出的血清S100B蛋白和NSE的最佳诊断截点，计算其对预测重症HFMD的价值，发现两项指标并联使用价值最高（表 6）。

表 6

表 6 血清S100B蛋白及NSE单独和联合检测对预测重症HFMD的价值

表 6 血清S100B蛋白及NSE单独和联合检测对预测重症HFMD的价值

重症HFMD患儿常合并脑干脑炎、神经源性肺水肿、肺出血，可遗留偏瘫等后遗症甚至致死。HFMD重症病例的发病机制尚未完全阐明，危重病例心肺衰竭的发生考虑与继发于神经系统损害尤其是脑干部位的损伤有密切关系^[8]。普通型HFMD即临床分期1期到重症HFMD即神经系统受累发生前是早期发现并有效干预的关键阶段。目前临床预测重症HFMD的特异指标十分有限，国内外学者早期诊断HFMD脑损伤的步骤主要建立在临床表现（如肢体抖动、血压升高等）、血糖、心肌酶、外周血白细胞总数、腰椎穿刺等检查的基础上^[1-4]。血糖、心肌酶、白细胞总数均为非特异指标；腰椎穿刺是有创检查，家长顾虑大甚至拒绝检查；神经影像学异常表现往往滞后临床且对脑损伤严重性判断不足；还有部分重症HFMD病例临床表现不典型或病情进展太迅猛，这些都成为临床早期、正确判断的障碍。近年来，一些能快速反映脑损害的生化指标如S100B蛋白、白介素-18和NSE等，越来越受到临床关注^[9]。

S100B蛋白是一种酸性钙结合蛋白，参与细胞增殖、分化、存活及迁移等过程^[10]。它特异性地存在于神经系统，约有96%存在于脑内，在中枢神经系统主要由星形神经胶质细胞分泌, 是神经胶质细胞的标志物。S100B蛋白具有分布的特异性和含量的相对稳定性的特点^[11]。正常情况下细胞外液含量很少，当胶质细胞受损后细胞完整性破坏可以大量进入细胞外液^[12]。S100B蛋白虽然具有神经营养作用，但是高浓度的S100B蛋白却有神经毒性作用，参与神经退化机制。细胞外高浓度的S100B蛋白可以刺激致炎细胞因子表达导致细胞凋亡，并能通过一氧化氮依赖途径诱导神经元细胞死亡^[13-14]。其过量表达与急性脑损伤有直接关系^{[9, 15]}。国外文献报道，部分脑损伤患者在影像学检查未发现损伤前血清S100B蛋白即有大幅度升高，此时，脑损伤尚处于无症状的亚临床状态，而结构上受损的神经胶质细胞会释放出S100B蛋白入血，此时升高的血清S100B蛋白可作为脑损伤的预测指标^[16]。由于S100B蛋白生物半衰期仅1~2 h，故动态观察可用来判断病情演变及预后^[17]。许多研究亦表明S100B蛋白水平升高及变化有助于多种神经系统疾病的诊断、病情监测和治疗指导^[18-20]。本研究显示治疗前急性期危重型组HFMD患儿血清S100B蛋白水平较其他3组明显升高，重型组HFMD患儿较普通型组和对照组明显升高，普通型组和对照组比较差异无统计学意义，提示中枢神经系统受损后血清S100B蛋白增高，与Unden等^[21]及孙宝迪等^[22]的研究一致。但Unden等^[21]的研究是以血清S100B蛋白 > 0.15 μg/L为界，孙宝迪等^[22]的研究最佳诊断截点则是血清S100B蛋白 > 0.23 μg/L，而在本研究中利用SPSS统计软件构建ROC曲线，最佳诊断截点是血清S100B蛋白 > 0.445 μg/L，这可能是由于研究对象的特征不同所致。孙宝迪等^[22]的研究对象为成人疑似中枢神经系统感染的病例，Unden等^[21]的研究对象则是中枢神经系统感染与颅外感染的患者均存在。而本研究的对象为儿童HFMD并神经系统损伤，为病毒感染引起，血清S100B蛋白最佳诊断截点偏高，与张利亚等^[23]的研究一致。本研究中血清S100B蛋白在0.445 μg/L时其Youden值最大，为0.611，其对重症HFMD预测的灵敏度为61%，特异度为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为46%。推测血清S100B蛋白水平在0.445 μg/L以上时，发生中枢神经系统损伤进展为危及生命的重症HFMD的危险性相对较大，提示在重症HFMD患儿存在神经胶质细胞损害，对血清S100B蛋白的测定有助于早期判断HFMD的严重程度，指导临床及时干预治疗。

NSE是一种存在于脑组织中而不存在于非神经组织中的酸性可溶性蛋白，特异性存在于神经元和神经内分泌细胞中，是神经元的标志物, 具有烯醇化酶的活性，是参与糖酵解的特异性关键酶，在脑脊液和血液中的含量甚微。当神经元水肿、变性、坏死时，NSE通过受损的胞膜及血脑屏障释放入血液，其血液水平与脑损伤程度呈正相关关系^[24]。本研究显示，治疗前急性期危重型组HFMD患儿血清NSE水平均较其他3组明显升高，重型组HFMD患儿较普通型组和对照组明显升高，普通型组和对照组比较差异无统计学意义；ROC曲线分析显示，血清NSE在5.905 μg/L时其Youden值最大，为0.533，其对重症HFMD预测的灵敏度为80%，特异度为73%，阳性预测值为90%，阴性预测值为55%，推测血清NSE水平在5.905 μg/L以上时，发生中枢神经系统损伤进展为危及生命的重症HFMD的危险性相对较大，提示在重症HFMD患儿存在神经元损害, 与有关报道一致^[25]。

由于免疫反应窗口期不同，S100B蛋白、NSE出现早晚和表达的高峰时间不一致。单独检测S100B蛋白时灵敏度为61%，特异度为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为46%，提示单独检测S100B蛋白特异度高，但其灵敏度较低，可能会使部分患儿漏诊，延误诊疗；单独检测NSE时灵敏度为80%，特异度为73%，阳性预测值为90%，阴性预测值为55%；两个指标串联检测的灵敏度为55%，特异度为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为43%；并联检测的灵敏度为86%，特异度为73%，阳性预测值为91%，阴性预测值为63%。串联检测时对重症HFMD的诊断较为确定，特异度达到100%，但灵敏度很低，易漏诊，延误早期诊断，无临床应用优势。而两项指标并联使用明显提高了灵敏度，特异度也较高，较单独检测和串联检测对早期预测重症HFMD的价值高，能指导临床早期干预，减少不良预后的发生。

另外，本研究还发现，治疗后恢复期好转的重症HFMD患儿与治疗前比较，血清S100B蛋白、NSE水平较前明显下降，差异均有统计学意义，提示S100B蛋白、NSE参与重症HFMD脑损伤的一系列复杂的病理生理过程，而且对判断病情变化、治疗效果有指导意义。重型组治疗后血清S100B蛋白、NSE水平下降，与对照组比较差异无统计学意义；而危重型组治疗后血清S100B蛋白、NSE水平虽下降，但仍高于对照组，提示危重型组HFMD患儿脑损伤程度更严重，恢复是一个更为缓慢的过程，与临床相符。

总之，早期并联检测并动态监测血清S100B蛋白及NSE水平，对评估HFMD病情严重程度、指导治疗、减少后遗症、降低病死率、探讨其发病机制具有重要意义；且血清检测较脑脊液测定更方便、更实用，成本较低廉，可操作性强，值得临床推广。