孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）是一类以社会交往障碍、语言沟通障碍、兴趣狭窄及重复刻板的异常行为模式为基本特征的神经发育性疾病^[1]。该病常起源于婴幼儿期，严重影响儿童的身心发育，给社会及家庭造成严重负担^[2]。据报道，我国儿童ASD患病率约为1.18‰，且近年来逐渐上升，与国外流行趋势相似^[3]。然而，该病的确切病因不明，遗传和环境因素及其交互作用可能与该病的发生发展有关，目前尚无特殊的治疗药物^[4]。叶酸是人体必需的一种B族维生素，在胚胎发育过程中具有重要作用，叶酸缺乏可能引起胎儿大脑发育障碍，进而影响其出生后神经系统的发育，与儿童ASD发病密切相关^[5]。近年来母亲孕期叶酸营养状况与其子女ASD发病风险的关系受到广泛关注，国内外已有多项研究显示母亲孕期补充叶酸可能降低其子女罹患ASD的风险^{[2, 6]}。然而部分研究报道孕期补充叶酸与子女ASD发病风险无明显相关性^[7-8]。既往研究结果的不一致可能与各研究的样本量不同及人种差异等因素有关。本研究采用Meta分析的方法旨在明确母亲孕期补充叶酸与其子女ASD发病风险的关联，为儿童ASD的预防提供可靠的证据。

全面系统检索PubMed、Embase、Scopus、Corchrane Liabrary、EBSCO、中国知网（CNKI）、万方（Wanfang Data）、维普（VIP）及中国生物医学文献数据库（CBD）等电子数据库，收集有关母亲孕期叶酸补充与儿童ASD发病风险的文献。其中文检索策略为：“叶酸” AND [“孤独症” OR “自闭症” OR “孤独症谱系障碍”]；英文检索策略为：[“folate” OR “folic acid”] AND [“Autism”OR“Autism spectrum disorder”OR“ASD”]。所搜索文献限中、英文报道，同时追溯所搜集相关文献的参考文献。

纳入标准：（1）有关母亲孕期叶酸补充与其子女ASD发病风险的文献（叶酸补充定义为母亲孕期自行或根据预防保健机构建议口服叶酸药物或摄入高叶酸饮食）；（2）所有病例均有国际认可或专家共识的诊断参考标准；（3）各纳入研究的设计、研究方法类似；（4）文献数据完整或者根据报告结果能够推算出Meta分析所需数据。排除标准：（1）同组研究对象反复报道、研究质量差（样本数 < 30，未讨论可能重要的偏倚因素，或研究对象随访时间 < 1年）、文献数据报告不完整或无法根据报告获得必要的数据；（2）病例报道、综述、评论性文章；（3）中、英文以外语种发表的文献。

所纳入研究严格参照英国牛津循证医学中心文献严格评价项目（Oxford Critical Appraisal Skill Program, Oxford CASP, 2004, http://www.casp-uk. net/）进行质量评价：（1）实验设计的科学性；（2）研究对象的纳入标准、诊断标准及基本构成特征是否明确；（3）统计学方法是否适合；（4）干预因素及方法是否准确；（5）是否讨论了研究可能的偏倚。以上5项，每合格一项记1分，总分≥3分者视为质量合格。由两名研究员依据统一标准进行文献质量评价及资料提取，然后进行交叉核对，意见不统一者通过讨论解决或者咨询第三名研究员。文献资料提取主要包含以下信息：第一作者、发表年份、国家、人群、样本量、相关风险比（OR）及其95%可信区间（95%CI）等，其中OR及其95%CI可从文献报告计算，或直接从文中提取，若同时报告了校正OR及其95%CI，则采用校正后的效应量。

采用Stata 12.0软件进行统计学分析，以OR及95%CI为合并效应量。首先进行异质性检验（Q检验），各研究间不存在明显统计学异质性时（P>0.1），采用固定效应模型进行合并分析，否则采用随机效应模型合并，I²衡量异质性大小^[9-11]。Z检验分析合并结果，P < 0.05认为结果具有统计学意义^[10]。用Stata 12.0软件进行分析，根据森林图的结果分析合并效应量及异质性情况，并绘制漏斗图直观检测发表偏倚，并运用Begg's及Egger' test进一步评价可能的发表偏倚^[12-13]，P < 0.05认为结果具有统计学意义。采用逐一剔除的方法进行敏感性分析。

根据确定的检索策略初检出相关文献177篇，根据标题和摘要初步剔除与研究主题不相关的文献136篇，进一步查找并阅读全文后排除31篇，包括综述性文章16篇，会议论文2篇，Meta分析1篇，其他维生素与ASD关系5篇，叶酸治疗ASD效果7篇，最终纳入10篇文献^{[2, 6-8, 14-19]}（表 1）。对于重复发表的研究，选取样本量最大及文献报告结果最详细者。所纳入的10篇文献中，英文文献6篇，中文文献4篇；研究对象为西方及亚洲人群各5篇。因Nilsen等^[17]的研究中包含两项独立队列研究，Schmidt等^[16]的研究根据不同叶酸摄入量进行了分层分析且报道了校正后的OR及95%CI，蒋辉等^[7]的研究中包含两个不同类型ASD，均视为独立研究，故本次Meta分析共纳入原始文献10篇，包含独立研究15项，累计病例4 459例，对照1 225 835例。所纳入文献中3篇为病例-对照研究，7篇为队列研究。根据文献质量评价标准，所有纳入研究质量合格（总分>3分）。所纳入各研究的基本情况见表 1。

表 1

表 1 纳入研究的基本情况

表 1 纳入研究的基本情况

总体人群异质性检验结果显示，纳入的各研究间存在统计学异质性（P=0.001，I²=60%），故采用随机效应模型合并。Meta分析结果显示，总体人群中，母亲孕期补充叶酸可显著降低其子女ASD发病风险（OR=0.798，95%CI：0.669~0.952，P=0.012）。按来自不同种族的人群进行亚组分析显示，亚洲人群中，母亲孕期补充叶酸可能与其子女ASD发病风险降低有关（OR=0.664，95%CI：0.428~1.032），但无统计学意义（P=0.069）；西方人群中，母亲孕期补充叶酸可降低其子女ASD发病风险（OR=0.817，95%CI：0.671~0.996，P=0.045）。Meta分析主要结果见表 2和图 1。

表 2

表 2 母亲孕期叶酸补充与子女ASD发病风险的Meta分析结果

表 2 母亲孕期叶酸补充与子女ASD发病风险的Meta分析结果

图 1 母亲孕期叶酸补充与子女ASD发病风险的Meta分析森林图 注：蒋辉2016[7]包含两个不同类型ASD，均视为独立研究；Schmidt 2012[16]根据不同叶酸摄入量进行了分层分析；Nilsen 2013[17]包含两项独立队列研究。

采用逐一剔除的方法进行敏感性分析，结果显示依次剔除任意一项研究后，Meta分析合并效应量均未发生明显变化，敏感性分析结果见图 2，提示本研究结果较为稳定。

图 2 敏感性分析

绘制漏斗图并采用Begg's test检测发表偏倚，结果纳入研究完整出现在漏斗图上（图 3），且大多数以效应量为中心散在分布（Begg's test Z=2.77，P=0.006）。进一步采用Egger's test进行发表偏倚分析，结果显示纳入合并分析的研究存在一定的发表偏倚（t=-2.97，P=0.011）。经公式法定量进行发表偏倚分析结果显示，需要增加146个无意义的研究才能使合并结果发生改变，提示发表偏倚对合并结果的影响较小^[20]。

图 3 母亲孕期叶酸补充与子女ASD发病风险的Meta分析漏斗图

ASD是世界范围内儿童精神障碍的重要原因，给儿童身心健康造成重大伤害，目前尚无特殊的治疗药物^[5]。ASD病因及发病机制复杂，既往研究发现一些围产期因素如妊娠期疾病、药物使用不当及父母年龄等可能与其子女ASD发病风险有关，然而具体机制不明^[21]。近期研究发现，母亲孕期血液叶酸浓度较低，其子女罹患ASD的概率显著增加，提示孕期叶酸缺乏可能增加子女ASD的患病风险^[22]。既往研究证实，叶酸作为一碳单位的载体参与基因甲基化过程，是人体核苷酸合成的重要元素，胎儿早期发育时基因合成旺盛，适量的叶酸可诱导胚胎神经干细胞增殖并促进其向神经元分化，并增强γ-氨基丁酸（A型）β1受体（GABRB1）的表达，促进胎儿神经系统的发育^[23]，反之，叶酸缺乏可破坏DNA的正常甲基化并影响基因的正常功能，进而影响胎儿神经系统的发育，因而可能增加儿童ASD易感性^[1]。此外，国内外多项研究也证实，ASD患儿给予叶酸辅助治疗可改善其认知及语言交流障碍^[24-26]。基于此，国内外多项研究试图验证母亲孕期补充叶酸与其子女ASD发病风险间的关联，然而研究结果不尽一致。挪威的一项大型研究结果发现母亲孕期补充叶酸可明显降低子女ASD发病风险^[6]，陈强等^[19]针对中国人群的研究也发现了类似结果；然而，Virk等^[8]研究显示在丹麦及美洲人群中，母亲孕期叶酸补充与儿童ASD发病风险无显著关联，孙艳丽等^[18]流行病学研究也发现，中国人群中母亲孕早期补充叶酸与其子女ASD易感性无明显相关性。

本研究采用Meta分析的方法，共纳入15项研究，定量分析了母亲孕期叶酸补充与儿童ASD发病风险的相关性，结果表明母亲孕期补充叶酸可降低其子女ASD发病风险。由于种族可能对结果具有重要影响，因此本研究根据来自不同种族的人群进行了亚组分析，结果显示，在亚洲人群中母亲孕期补充叶酸可能可降低其子女ASD易感性，但未达到统计学意义；而在西方人群中，母亲孕期补充叶酸可降低其子女ASD发病风险，有统计学意义。研究结果在不同种族人群间的差异性可能与东西方生活饮食习惯不同有关，叶酸主要富含于植物性饮食中，亚洲人群生活以植物性饮食为主，其中叶酸含量较为充足，而西方人群以动物性饮食为主，人体叶酸可能相对缺乏，故而西方人群中母亲孕期补充叶酸对其子女罹患ASD的预防作用可能更为明显。此外，本研究对合并分析结果进行了敏感性分析，结果发现总效应量未发生明显变化，提示研究结果较为可靠。

此外，本研究还进行了发表偏倚分析，结果提示可能存在一定的发表偏倚，但经过公式法分析结果显示发表偏倚对合并分析的结果影响较小，也说明本研究结果较为可靠。尽管本研究通过Meta分析的方法扩大了样本量，提高了统计效能，但仍存在一定的局限性：（1）有研究报道围孕期叶酸补充剂的最佳摄入量是0.66 mg/d^[27]，过高或过低摄入均不利于胎儿发育^[28]，如Raghavan等^[29]最近发现孕期母亲血液叶酸浓度过高（>59 nmol/L）可能增加子女ASD发病风险。而本Meta分析所纳入的原始文献较少根据母亲叶酸摄入量进行分层分析，可能影响研究结果的准确性。（2）ASD是基因与环境交互作用的结果^[30]，参与叶酸代谢的关键酶如MTHFR的活性水平及其基因多态性可能影响叶酸在ASD中的作用^[31]，但所纳入的原始文献未对此进行分析。（3）有研究指出儿童ASD发病率存在一定性别差异，男孩发病率高于女孩^[32]，然而由于原始文献数据的限制，本研究未分析性别差异。（4）所纳入的多项研究均采用自我报告而非生物指标的形式评估母亲孕期的叶酸摄入情况，其结果可能存在报告偏倚。（5）叶酸与ASD的关系可能受多种混杂因素的影响，如叶酸的补充剂量、方式、时间以及ASD的诊断标准、随访时间，由于原始文献数据的限制，相关信息无法完整知晓，其采用的基线标准可能不完全一致。

综上，本Meta分析结果显示，母亲孕期补充叶酸可能可降低其子女ASD发病风险，这种作用在西方人群中明显一些。考虑到本研究的局限性，期待未来开展更多高质量、同质性较好、设计更为严密的大样本研究，以进一步准确科学地评价母亲孕期补充叶酸对儿童ASD的预防作用，为ASD的临床预防提供更加可靠的证据。