2017, Vol. 19
2. 深圳市出生缺陷预防控制重点实验室, 广东 深圳 518000
结节性硬化症（tuberous sclerosis complex, TSC）属于常染色体显性遗传的神经皮肤综合征，发病率较低，约1/6 000~10 000，家族遗传约1/3[1]。以多组织、多器官的错构瘤损害为主要特征，常可累及大脑、皮肤、心脏、肾脏、肺和眼等[2]。临床表现各异，且具有年龄相关性，成人症状较儿童多，但除心脏错构瘤外[3]。其致病基因为TSC1和TSC2，二者均属肿瘤抑制基因，TSC1基因位于9q34，包含23个外显子，第1和第2外显子分别为非编码区和选择性剪接位点，编码产物为错构瘤蛋白（hamartin）；TSC2基因位于16p13.3，包含41个外显子，编码产物为马铃薯蛋白（tuberin）。
TSC1和TSC2的致病突变包括无义突变、框移突变、剪接突变、缺失或插入和一些错义突变，二者均无突变热点。临床诊断为TSC的患者约85%经测序可检测到突变。测序阴性者，采用多重连接依赖性探针扩增技术（MLPA）检测大片段缺失和重排，TSC1和TSC2检出率分别为0.5%和6%[4]。本文就TSC2基因两个新发框移突变作如下讨论。
1 资料与方法 1.1 研究对象家系1先证者，女，4岁，无缺氧窒息史，母孕期无异常，1岁半独走。生后2个月于面部右侧颞部发现一色素脱失斑（图 1A）。生后6个月反复无诱因点头，4~6次/d，持续2~10 s/次。生后7个月颅脑MRI检查提示双侧侧脑室壁小结节灶及双侧大脑半球皮层下异常信号。1岁半复查CT提示双侧侧脑室壁边缘小结节灶较前有所增加（图 1B），双侧大脑半球皮层/皮层下小片状低密度灶，部分伴钙化，TSC可能。脑电图异常，清醒时双侧枕颞额大量尖慢波发放，临床痉挛发作伴高幅慢波出现。双肾B超未见异常。2岁时面部可见少量血管纤维瘤，逐渐增多。采集外周血送深圳华大基因研究院行TSC相关基因的高通量测序，结果提示TSC2基因c.3981-3982 insA（p.Asp1327AspfsX87）杂合突变。经解痉、抗癫癎治疗，现发作仍无减少，睡醒时易发作，有时玩耍中有张口、傻笑等动作，心跳加快，伴点头3~4次，发作后疲劳入睡，每天发作7~8次。有时继发双手僵硬，双眼斜视，喉中惊恐样发声，1~2次/周。现只会叫“爸爸”“妈妈”两个词且吐字不清，能听懂父母少部分话语，但不能执行指令，且有自闭症倾向。全身可见4处无规则色素脱失斑，服用雷帕霉素后，面部血管纤维瘤部分消退。先证者父母均无TSC相关症状。
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图 1 家系1先证者皮肤改变和影像学特征 A：右侧颞部一片状色素脱失斑；B：1岁半头颅CT检查示右侧侧脑室旁2个点状高密度钙化灶（红色箭头所示），左侧侧脑室旁可见1个点状高密度钙化灶（黑色箭头所示）。 |
家系2先证者，女，9岁，出生史无异常，两颊面部见散在血管纤维瘤，腹部见钙化星形细胞错构瘤及小片状色素脱失斑。6岁时，间断无诱因抽搐2次，颅脑CT检查提示右侧侧脑室室管膜下见多发钙化灶影，考虑TSC。脑电图提示为界限，睡眠中见左侧中后颞区为主可疑尖波散发和睡眠背景欠佳。8岁时，颅脑CT检查提示两侧侧脑室旁多发钙化（图 2A），癫癎大发作共3次，双肾、心脏、肝、胆、胰、脾B超均未见异常。经抗癫癎治疗，效果较好。外周血经华大基因行高通量测序，结果提示为TSC2基因c.4013-4014 delCA（p.Ser1338Cysfs）杂合突变。现精神运动发育尚可，学习成绩中上水平，身高体重均处于同龄人水平。先证者母亲，自幼面部可见对称性针尖样血管纤维瘤，右侧腰部见钙化星形细胞错构瘤（图 2B），前胸、双上肢散在分布小片状色素脱失斑，共4处。经家系一代测序验证，先证者母亲亦存在TSC2基因c.4013-4014 delCA杂合突变。先证者父亲、外祖父母均无TSC相关症状。
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图 2 家系2先证者影像学特征和先证者母亲皮肤改变 A：先证者头颅CT检查示右侧侧脑室旁两个点状钙化灶（箭头所示）；B：先证者母亲右侧腰部钙化星形细胞错构瘤。 |
1.2 外周血基因组DNA提取
在知情同意的前提下，取家系1、2先证者、先证者父母和家系2先证者外祖父母外周血2~3 mL，EDTA-K2抗凝，采用GentraPuregene Blood Kit（Qiagen公司生产）试剂盒提取基因组DNA，操作步骤按照说明书。检测DNA纯度和浓度（Nanodrop2000蛋白核酸分析仪），要求DNA纯度在1.8~2.0之间，浓度在20~100 ng/μL之间。
1.3 TSC相关基因高通量测序分析委托深圳华大临床检验中心将先证者DNA打断并制备文库，通过定制芯片对TSC1和TSC2目标基因的编码区及邻近剪切区的DNA进行捕获和富集，最后使用高通量测序平台进行突变检测。检测基因目标区长度约26 579 bp，目标区覆盖度95%以上，目标区平均深度509.58×，目标区平均深度>30×位点所占比例为100%。
1.4 引物设计NCBI查询TSC2基因序列（NG_005895），根据高通量测序筛选出的突变位点，采用Primer Premier 6.0设计引物并由上海生工公司合成，引物序列见表 1。
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表 1 TSC2基因相应突变位点扩增引物 |
1.5 PCR扩增
应用立陶宛Thermo Scientific公司试剂，反应体系：ddH2O 15.5 μL，Buffer、Mg2+、dNTP各3 μL，正反引物各1 μL，Taq DNA酶1.5 μL，模板DNA 2 μL，总体系为30 μL。扩增条件：96℃ 3 min预变性；94℃ 1 min变性，退火1 min（相应退火温度见表 1），72℃延伸1 min，35个循环；72℃ 3 min，使PCR反应完全以提高扩增产量。取扩增产物5 μL，TaKaRa公司生产的6×Loading Buffer 1 μL，混匀，2%琼脂糖（Biowest Agarose）凝胶电泳以验证产物特异性。
1.6 PCR产物序列测定取PCR扩增产物25 μL，用表 1中PCR扩增引物作测序引物，测序委托上海生工公司完成。具体步骤如下：PCR产物纯化（生工公司纯化试剂）；2%琼脂糖凝胶电泳确认其纯度和浓度（Biowest Agarose琼脂糖粉，生工公司的marker）；根据PCR产物长度确定DNA模板浓度（长度为200~500 bp的模板用量为2~10 ng），DNA测序反应（ABI PCR仪，美国）；产物上机前用酒精纯化；上测序仪（ABI 3730XL）；采用Chromas软件分析数据。
2 结果家系1先证者检出TSC2基因c.3981-3982 insA（p.Asp1327AspfsX87）杂合突变（图 3），先证者父母该位点均未见异常。该框移突变导致氨基酸序列在第1413位提前终止编码，其致病性尚未见文献报道。家系2先证者、先证者母亲均检出c.4013-4014 delCA（p.Ser1338Cysfs）杂合突变（图 4），为母源性遗传，先证者父亲、先证者外祖父母该位点均未见异常。该框移突变导致氨基酸序列在第1412位提前终止编码，其致病性亦未见文献报道。
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图 3 TSC2基因c.3981-3982 insA杂合突变测序结果 上图为正常对照，下图为先证者c.3981-3982 insA杂合突变，箭头所示为突变位点。 |
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图 4 TSC2基因c.4013-4014 delCA杂合突变测序结果 上图为正常对照，下图为先证者c.4013-4014 delCA杂合突变，箭头所示为突变位点。 |
两突变在HGMD数据库（www.hgmd.cf.ac.uk/ ac/index.php）里未查出；在千人基因组计划数据库中检出频率为0；在深圳华大基因收集的大于200例本地正常人测序样本中的发生频率为A（发生频率0~0.01为A；0.01~0.05为B；0.05~1为C）；用Mutationtaster软件（www.mutationtaster.org/）对其进行突变功能预测，预测分数均为1（预测结果分数范围为0~1，分数越高提示致病可能性越大）。
3 讨论TSC1编码的错构瘤蛋白和TSC2编码的马铃薯蛋白二者在细胞质内形成复合物，间接调控细胞增殖、细胞分裂和细胞黏附等，当任一基因发生突变时，胞内复合物形成受阻，对细胞增殖的抑制作用减弱或消失，造成细胞增殖过快而出现错构瘤损害[5]。TSC1-TSC2复合物在细胞中发挥作用是通过TSC2的GAP功能域（GTPase激活蛋白）间接激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白途径（mTOR），进而通过核糖体蛋白S6激酶（S6K）去磷酸化以达到抑制蛋白质合成、细胞生长、增殖和自我吞噬的作用[6]。因此，TSC1-TSC2复合物形成异常、TSC2基因突变造成GAP域异常和mTOR磷酸化水平异常，均可出现TSC相关临床表现。TSC2基因主要有两个功能域，即Hamartin结合域和GAP域[7]，经Swiss-prot软件（www.uniprot.org/）在线查询可知GAP功能域位于第1531~1758位氨基酸，本研究讨论的TSC2基因c.3981-3982 insA（p.Asp1327AspfsX87）突变导致氨基酸序列在第1413位提前终止编码，c.4013-4014 delCA（p.Ser1338Cysfs）突变导致氨基酸序列在第1412位提前终止编码，二者均终止于GAP功能域前，导致GAP域全部缺失，为两家系的致病原因。
有不少国内外文献已报道错义突变、无义突变和框移突变导致GAP功能域异常，从而引发疾病。Mayer等[8]曾报道1例临床症状较轻的TSC，发现TSC2基因c.4684G>A（G1556S），此错义突变位于GAP域内，导致非极性的甘氨酸变成极性的丝氨酸，抑制S6K磷酸化的能力减弱，引起信号通路异常而致病。Chen等[9]在产前诊断中发现1例TSC2基因无义突变，即c.4830G>A（W1610X），此突变造成氨基酸编码发生提前终止，GAP功能域部分缺失，引起心脏横纹肌瘤和脑内异常等表现。Yu等[10]报道1例致病性的缺失突变TSC2基因c.2690delT（p.Phe897SerfsX947），此框移突变导致GAP功能域完全缺失，引起一系列临床症状。
本研究讨论的TSC2基因c.3981-3982 insA、c.4013-4014 delCA在HGMD数据库（www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）里未查出；在千人基因组计划数据库中检出频率为0；在深圳华大基因收集的大于200例本地正常人测序样本中的发生频率为A（发生频率0~0.01为A）；用Mutationtaster软件（www.mutationtaster.org/）对其进行突变功能预测，预测分数均为1（预测结果分数范围为0~1，分数越高提示致病可能性越大）。经过文献复习、氨基酸结构分析，结合先证者临床表现等，推测这两个框移突变为新发的致病性突变，但是突变蛋白功能仍需要细胞模型和动物模型的进一步验证，突变体结构需要X衍射等技术的检测。
TSC2基因大，致病突变数量多，嵌合型比例高，基因检测非常复杂。明确基因突变有助于TSC家系遗传咨询和利用分子遗传学方法进行早期产前诊断。Curatolo等[11]在研究TSC基因型与表型的关系中阐明，TSC2突变引起的临床症状较TSC1更严重，如更易发生智力低下、癫癎、面部血管纤维瘤等。本研究中TSC2基因两突变先证者均有癫癎和面部血管纤维瘤表现，其中c.3981-3982 insA突变患儿临床表型严重，发病年龄较小，而c.4013-4014 delCA突变患儿表型较轻，智力发育正常。由于c.3981-3982 insA突变导致腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）[12]介导的磷酸化功能缺失，而c.4013-4014 delCA突变后此功能尚存在，因此推测这是TSC2基因c.3981-3982 insA突变较c.4013-4014 delCA表型严重的原因。
综上，本研究检出的TSC2基因c.3981-3982 insA、c.4013-4014 delCA突变为新发致病性框移突变，这两个新发突变的发现不仅丰富了基因突变谱，也为患病家系产前基因诊断提供了依据。
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