食物过敏（food allergy, FA）是指机体被某种食物致敏后，再次接触该食物，所产生的异常免疫反应。流行病学调查显示，儿童FA的发病率约为4%~7%，并以较高的速度逐年增长，严重影响了儿童的健康成长和生命安全。部分患儿在FA后能产生免疫耐受，但目前免疫耐受的机制尚不清楚。

免疫系统拥有对过敏原产生免疫耐受的外周机制，调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）发育发展是微生物清除减弱、保持微生物持续存在和限制相应组织损伤的结果^[1]。根据表面标志、产生细胞因子和作用机制的不同，可将Treg分为CD4⁺CD25⁺Treg、Th1、Th3、自然杀伤T细胞等。CD4⁺CD25⁺Treg是日本学者Sakaguchi等^[2]于1995年首次报道。其中CD4⁺CD25⁺Treg是一群具有免疫抑制功能的细胞亚群，可通过直接接触和/或分泌抑制性细胞因子来下调机体免疫系统对抗原的免疫反应性，在机体免疫系统中执行负向调节免疫反应的功能，对维持免疫自稳起到至关重要的作用。本实验通过建立FA模型，观察非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤核苷酸（CpG-ODN）及脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cell, ADSC）对FA小鼠干预治疗后CD4⁺CD25⁺Treg表达水平的影响，探讨其在FA发病机制中的免疫调节作用。

取10只SPF级6~8周龄BALB/c雌性小鼠，用于ADSC的分离、培养与诱导^[3]；另取40只SPF级2~3周龄BALB/c雌性小鼠，随机分为对照组、过敏组、ADSC治疗组（简称ADSC组）、非甲基化CpG-ODN治疗组（简称CpG-ODN组），每组10只。所有小鼠均购买并饲养于中国科学院动物研究所SPF级动物房，在实验前均给予适应性饲养2 d，给予不含卵清蛋白（OVA）饲料饲养，自由进食、饮水。

胎牛血清（德国Biochrom AG公司）、DME/F12培养基（美国Hyclone公司）、Ⅰ型胶原酶（美国Sigma公司）、0.25%胰蛋白酶、10×磷酸缓冲盐溶液（PBS）（北京雷根生物技术有限公司）、0.9%氯化钠注射液（中国大冢制药有限公司）、OVA（V级，美国Sigma公司）、非甲基化CpG-ODN1826（上海生工生物股份有限公司）、CD4-FITC、CD25-PE、Rat IgM-PE（德国Miltenyi公司）。

参照文献^[3]，将小鼠颈椎脱臼，取腹股沟处脂肪，消化、离心、接种、培养。取第3代ADSC，给予成脂诱导培养基诱导分化，2周后进行油红O染色鉴定。染色鉴定步骤：取出细胞培养板，每孔均加入4%多聚甲醛固定15 min后，自来水洗板2次，每次2 min；再用超纯水洗板2次，每次2 min；每孔再加入60%的异丙醇溶液，放置约30 s，加入油红O染液染色20 min后，放入75%的酒精进行分色，再用蒸馏水清洗；然后加入Mayer苏木素染液，复染3 min；再加入ORO Buffer放置1 min；流水冲洗，晾干，倒置显微镜下观察，拍照。

取第3代ADSC，给予成骨诱导培养基诱导分化，3周后进行茜素红染色鉴定。染色鉴定步骤：取出细胞培养板，PBS洗板3次，每孔均加入4%多聚甲醛固定10 min后，超纯水清洗3遍，加入2%茜素红染液染色30 min，蒸馏水洗板3次，晾干，倒置显微镜下观察，拍照。

FA模型建立参照文献^[3-5]。基础致敏：实验第0、14天，过敏组、ADSC组、CpG-ODN组腹腔注射OVA致敏液0.2 mL/只（250 μg/mL）。激发致敏：实验第17、20、23、26、29天，过敏组、ADSC组、CpG-ODN组以OVA致敏液0.3 mL/只（2 mg/mL）灌胃；其中CpG-ODN组在每次灌胃激发前1 h，给予腹腔注射非甲基化CpG-ODN溶液0.08 mL/只（约40 μg）。ADSC组在实验第15、30天给予腹腔注射ADSC细胞悬液0.2 mL/只（细胞数约为1×10⁶个）。对照组在基础致敏和激发致敏阶段均用0.9%氯化钠注射液代替。观察各组小鼠致敏前后过敏症状，并给予评分。

过敏症状评分标准参照文献^[3-5]。0分：无明显症状；1分：抓耳挠腮，抓挠身体其他部位；2分：口周红、腹泻、易激惹、呼吸急促；3分：眼睛嘴巴浮肿、尾巴紫绀、呼吸浅慢；4分：活动低下或无活动；5分：死亡。

FA模型建立后4~6 h，各组小鼠摘除眼球取血，每只小鼠取0.2 mL血置于抗凝管中，而后置于流式管中，采用流式细胞仪检测外周血中CD4⁺CD25⁺Treg的含量，具体步骤参照说明书；另取0.6 mL血置于EP管中，离心后取血清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中OVA-IgE的含量，具体步骤参照说明书。

取各组小鼠空肠置于中性福尔马林中固定，脱水、包埋、切片，苏木素-伊红（HE）染色，显微镜下观察。

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计学分析，正态分布计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

取第3代ADSC，给予成脂诱导5~6 d后，发现细胞内出现小脂滴，继续诱导脂滴逐渐增大并且融合，诱导2周后给予油红O染色可见大量脂质，见图 1。

图 1 成脂诱导2周鉴定结果（油红O染色，×400） 脂滴形成，呈现红色（箭头所示）。

取第3代ADSC，给予成骨诱导约1周，细胞形状呈现为多角形，胞质内可见少许颗粒；约2周时细胞呈现出集落样生长，有钙质沉积；3周时细胞呈融合状态，出现明显的钙结节，给予茜素红染色呈现为红色，见图 2。

图 2 成骨诱导3周鉴定结果（茜素红染色，×200） 可见红色的钙结节堆积成片（箭头所示）。

建模完成后，各组小鼠过敏症状评分比较差异有统计学意义（F=98.0，P < 0.001）。其中过敏组过敏症状评分（6.5±0.7）分别高于对照组（0.2±0.4）、ADSC组（4.1±1.1）和CpG-ODN组（4.5±1.0）（P < 0.01）；ADSC组与CpG-ODN组间过敏症状评分比较差异无统计学意义（P > 0.05），但均高于对照组（P < 0.05）。

过敏组小鼠黏膜层绒毛结构破坏，顶部可见水肿，大量的嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润，符合Ⅰ型变态反应的特点；对照组小鼠黏膜层绒毛结构完整，未见水肿，无嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润；ADSC组小鼠黏膜层绒毛结构部分破坏，无明显水肿，有少量嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润；CpG-ODN组小鼠黏膜层绒毛结构部分破坏，无水肿，有少量嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润（图 3）。

图 3 各组小鼠空肠黏膜形态及结构（苏木精-伊红染色，×400） A：对照组小鼠空肠黏膜层绒毛（黑色箭头所示）结构完整，无水肿及炎性细胞浸润；B：过敏组小鼠空肠黏膜层绒毛结构破坏（黄色箭头所示），顶部可见水肿，大量的嗜酸性粒细胞（绿色箭头所示）及淋巴细胞浸润；C：ADSC组小鼠空肠黏膜层绒毛结构部分破坏，无明显水肿，有少量嗜酸性粒细胞及淋巴细胞（红色箭头所示）浸润；D：CpG-ODN组小鼠空肠黏膜层绒毛结构部分破坏，无水肿，有少量嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润。

与对照组相比，过敏组血清中OVA-IgE水平升高（P < 0.05）；ADSC组、CpG-ODN组血清OVA-IgE水平低于过敏组（P < 0.05），但仍高于对照组（P < 0.05）；ADSC组血清OVA-IgE水平与CpG-ODN组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。提示ADSC和非甲基化CpG-ODN均可降低过敏小鼠血清中OVA-IgE水平；且两种治疗方法对降低过敏小鼠血清OVA-IgE水平无差异。见表 1。

表 1

表 1 各组小鼠血清OVA-IgE及外周血CD4+CD25+Treg表达水平比较 （n=10，x±s）

表 1 各组小鼠血清OVA-IgE及外周血CD4+CD25+Treg表达水平比较 （n=10，x±s）

与对照组相比，过敏组外周血中CD4⁺CD25⁺Treg水平降低（P < 0.05）；ADSC组、CpG-ODN组外周血中CD4⁺CD25⁺Treg水平均高于过敏组（P < 0.05），且与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05），说明ADSC和非甲基化CpG-ODN均可提高过敏小鼠外周血中CD4⁺CD25⁺Treg的表达水平；ADSC组外周血CD4⁺CD25⁺Treg水平与CpG-ODN组比较差异无统计学意义（P > 0.05），说明两种治疗方法对提高过敏小鼠外周血CD4⁺CD25⁺Treg表达水平无明显差异。见图 4，表 1。

图 4 流式细胞术检测各组小鼠外周血中CD4+CD25+Treg表达水平 A为空白对照；B为同型对照；C为对照组；D为过敏组；E为ADSC组；F为CpG-ODN组。R3区域表示CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞的百分比。

ADSC、非甲基化CpG-ODN对FA患者体内CD4⁺CD25⁺Treg表达水平的影响报道较少，既往研究提示CD4⁺CD25⁺Treg与免疫耐受有关，本课题组推测在FA中可能存在CD4⁺CD25⁺Treg数量减少和/或功能不全，非甲基化CpG-ODN及ADSC可能提高FA模型小鼠外周血中CD4⁺CD25⁺Treg的表达水平，本研究从CD4⁺CD25⁺Treg的角度对FA免疫耐受机制做进一步探讨。

Treg是一类具有免疫调节功能的T淋巴细胞亚群，在维持机体免疫平衡方面起着重要作用^[6]。在Treg家族中，CD4⁺CD25⁺Treg是最重要的，也是研究最多的。CD4⁺CD25⁺Treg是一类专职免疫细胞，发挥非特异性免疫抑制作用，不受组织相容性复合体的限制。相关研究发现，CD4⁺CD25⁺Treg数量减少和/或功能紊乱均可导致各种免疫性疾病^[7]。本实验研究结果显示，过敏组小鼠外周血中CD4⁺CD25⁺Treg表达水平低于对照组。目前认为其发生的机制可能是：（1）CD4⁺CD25⁺Treg可与树突状细胞相互作用，抑制对T细胞的抗原提呈作用，直接或间接发挥免疫负向调节作用，诱导效应T细胞凋亡^[8]；（2）CD4⁺CD25⁺Treg通过分泌具有免疫抑制作用的细胞因子（如TGF-β1、IL-10），发挥免疫调节作用；（3）在趋化因子的作用下，CD4⁺CD25⁺Treg可迁移至免疫应答的部位，通过其细胞表面的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4与效应细胞的相关配体结合，发挥免疫抑制作用^[9]。当CD4⁺CD25⁺Treg数量减少，免疫抑制效能不足，可能是引起小鼠FA的主要机制之一。

本课题组前期研究已表明，非甲基化CpG-ODN及ADSC对FA及其相关细胞因子有一定的干预作用^[3-5]。本研究旨在观察非甲基化CpG-ODN、ADSC对FA小鼠外周血CD4⁺CD25⁺Treg的影响，探究其发病机制。间充质干细胞是一种具有分化增殖和自我更新潜能的多能性干细胞，具有免疫调节和低免疫原性的特点^[10-11]。ADSC是除骨髓间充质干细胞（MSCs）外重要的间充质干细胞来源，其组织来源丰富，具有非特异性的免疫调节能力，现已广泛用于各种炎性疾病及免疫性疾病的研究^[12-13]。Kavanagh等^[14]以及Nemeth等^[15]在实验中发现，MSCs使得CD4⁺Foxp3⁺Treg的表达水平上调，能够有效地减轻过敏性疾病的症状。Kavanagh等^[14]对哮喘大鼠模型进行MSCs移植，结果发现MSCs组大鼠的CD4⁺CD25⁺Treg水平明显高于模型组。通过检测过敏性鼻炎小鼠模型中IL-10及其mRNA的水平，提示回输ADSC可显著增加IL-10及其mRNA的表达水平^[16]。与上述实验结果类似，本研究结果显示：ADSC干预组小鼠CD4⁺CD25⁺Treg的表达水平高于过敏组，可能与ADSC上调了外周血中CD4⁺CD25⁺Treg水平，TGF-β1分泌增加，抑制T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞的增殖与活化^[17]有关，从而抑制了过度或偏移的免疫反应，使过敏症状减轻。

CpG-ODN是以胞嘧啶、鸟嘌呤结构为核心的寡核苷酸序列，是一种新兴的免疫佐剂。CpG-ODN主要与表达在树突状细胞及单个核细胞等免疫细胞上的识别受体—Toll样受体9结合，发挥免疫调节作用。CpG-ODN可使巨噬细胞和NK细胞活化，分泌IFN-γ、IL-12，诱导Th1反应，同时抑制IL-4、IL-5的分泌，使Th2反应向Th1反应逆转，维持Th1/Th2平衡。相关研究发现，CpG-ODN与Toll样受体9结合可以调整体内的骨化三醇，从而诱导调节性T细胞分泌IL-10，调控免疫反应^[18]。本实验结果显示：CpG-ODN组小鼠外周血CD4⁺CD25⁺Treg水平高于过敏组，说明非甲基化CpG-ODN可以提高外周血中CD4⁺CD25⁺Treg水平。

本研究提示，ADSC、非甲基化CpG-ODN干预治疗可以降低FA幼鼠过敏症状评分，改善症状，同时，也可明显降低其血清中OVA-IgE含量，提高CD4⁺CD25⁺Treg表达水平，且两种治疗方法疗效相当，在诱导FA免疫耐受中发挥作用，但具体机制尚需深入研究。