肠上皮细胞紧密连接（tight junction, TJ）的完整性是维持肠黏膜屏障功能的必备条件，肠黏膜屏障功能受损，肠壁渗透性增高，肠腔内的致病菌等有害物质进入黏膜组织和循环系统，导致炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）及全身炎症反应等^[1]。闭锁蛋白1（zonula occludens protein-1, ZO-1）是构成TJ的主要结构蛋白，其表达量和/或位置分布的改变均能影响肠黏膜屏障功能^[2]。目前已有多项研究证实，IBD患者肠道中粘附侵袭性大肠杆菌（adherent-invasive Escherichia coli, AIEC）明显增多^[3-4]。自1998年在克罗恩患者的病变回肠组织中发现具有粘附、侵袭能力的大肠杆菌（E.coli）LF82之后，该菌种被广泛用于AIEC相关的研究中^[5]。E.coli LF82通过菌毛与黏膜表面受体人癌胚抗原相关细胞粘附分子6（CEACAM6）相结合，粘附、侵入肠上皮细胞，在细胞内生存并复制，介导细胞释放大量炎症因子TNF-α，而TNF-α又可诱导CEACAM6高表达，导致肠道持续性炎症^[6]。同时，TNF-α可抑制ZO-1 mRNA转录而影响ZO-1的表达，从而破坏肠上皮紧密连接的完整性^[7]。二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, EPA）能有效预防紧密连接结构的破坏，并具有抗炎作用^[8-9]。人结肠癌细胞株Caco-2细胞，在正常培养条件下，能分化并融合成连续的单层细胞，具有类似于肠上皮细胞的功能和结构^[10]。因此本研究以EPA和/或E.coli LF82菌种作用于Caco-2细胞，旨在探讨EPA对E.coli LF82感染后的ZO-1 mRNA的影响。

粘附侵袭性大肠杆菌LF82菌株（E.coli LF82，法国克莱蒙费朗第一大学Darfeuille-Michaud教授馈赠）；Caco-2细胞（ATCC）；DMEM高糖培养基、胰酶（Hyclone，美国）；胎牛血清（Gibco，美国）；酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂糖（OXOID，英国）；细胞培养瓶、细胞培养板、细菌培养皿（Corning，美国)；插入式细胞培养皿（6.5 mm直径，0.4 μm孔径）、玻璃细胞培养小室（Millicell® EZ SLIDE，8孔）（Millipore，美国）；氨苄青霉素、EPA（相对分子量302，Sigma，美国)；Trizol（Life Technologies，美国）；反转录试剂盒（Thermo Scientific，美国）；2×Realstar Green Power Mixture（GenStar，北京）；人TNF-α ELISA试剂盒（ExCell Biotech，上海）；碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）；PCR引物由上海生工合成。

新鲜配置并高压灭菌LB培养基，在无菌培养板（含氨苄青霉素50 μg/mL）中挑取E.coli LF82菌株单克隆，接种于LB培养液，放入振荡孵箱，以37℃、220 r/min培养约14 h至生长平台期。吸取100 μL，连续梯度稀释，分光光度计600 nm处测定吸光值。当OD=1时，细菌培养液的浓度为1×10⁹ CFU/mL。

DMEM中加入10%胎牛血清、1%双抗（青霉素和链霉素），在37℃，含5%CO₂条件下培养Caco-2细胞，隔天换液，当细胞生长至80%~90%融合时，用0.25%的胰酶-EDTA常规消化、传代。将2×10⁴个细胞（200 μL）接种于Transwell细胞培养小室内，将细胞小室放入24孔板内（含1.3 mL细胞培养液），隔天换液，并在倒置显微镜下观察细胞形态，21 d左右形成单层，即可用于后续实验。

Caco-2细胞接种于96孔板，每孔约2×10⁴细胞，培养24 h。分5组：对照组（EPA 0浓度），EPA 25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L组，每组5个复孔，实验重复3次。孵育96 h后收集细胞及上清，检测细胞存活率、凋亡率、ZO-1 mRNA及TNF-α表达。

EPA处理96 h后，加入无血清细胞培养液和E.coli LF82（MOI=100 : 1），培养6 h、12 h，收集细胞及上清，检测ZO-1 mRNA及TNF-α的表达。

消化处于对数生长期的各组Caco-2细胞，制成单细胞悬液并计数，调整细胞浓度至1×10⁵/mL，以每孔2×10⁴（200 μL）细胞接种于96孔板。分别于接种后第3、6、9、12、16、19和21天取5个孔，PBS清洗，每孔加5 mg/mL的MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h，弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，室温避光震荡10 min，使紫色结晶物充分溶解。以空白孔调零，在酶联免疫检测仪上490 nm波长处测定吸光度A值，绘制细胞生长曲线；并检测各组吸光度（A）值。

Caco-2细胞存活率（%）=（A_EPA-A_空白）/（A_对照-A_空白）。

分别在接种于Transwell细胞小室内的各组细胞培养至第5，9，13，17，19，21天，取Caco-2细胞单层顶端（AP侧）及底侧（BL侧）适量培养基。按ALP检测试剂盒说明书操作，酶联免疫检测仪测定各组吸光度值，根据标准曲线计算ALP含量。

细胞接种于6孔板，每孔约1×10⁵个细胞，培养24 h后分5组予以EPA干预：对照组（不含EPA），EPA 25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L组，每组5个复孔，实验重复3次。不同浓度EPA与Caco-2细胞孵育96 h，流式细胞仪检测各组细胞凋亡，操作按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书进行。

按照TRIzol试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，逆转录cDNA，-20℃保存。采用三步法Real-time Q-PCR检测ZO-1 mRNA。反应体系为25 μL，预变性：95℃，10 min；变性：95℃，15 s；退火：53℃，30 s；延伸：72℃，35 s；循环次数：40次。ZO-1上游引物：5'-CAGAACCAAAGCCTGTG-TATG-3'，下游引物：5'-TTAGGTAGGACACCAT-CAGATGGA-3'。内参GAPDH上游引物：5'-GCACC-GTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物：5'-ATGGTGG-TGAAGACGCCAGT-3'。以GAPDH mRNA的CT值标化ZO-1 mRNA的CT值，得到ZO-1 mRNA相对CT值，采用2^-ΔΔCt法进行计算。

收集各组的上清液，采用人TNF-α ELISA试剂盒，以标准品浓度1 000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.25 pg/mL、15.62 pg/mL、0 pg/mL的OD值作标准曲线，根据标准曲线计算待测样品TNF-α含量。

应用SPSS 19.0统计软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

在细胞接种后第2天，倒置显微镜观察Transwell小室内的细胞：细胞呈多边形、贴壁；第5天，细胞呈上皮样形态，融合成片，细胞与细胞之间有清晰的边界且排列整齐；一周后，由于聚碳酸酯膜的影响，镜下很难清楚地观察到细胞形态。见图 1。

图 1 Caco-2细胞形态观察（10×20） A：培养第2天，细胞贴壁，呈多边形；B：培养第5天，细胞融合成片，边界清晰。

MTT结果显示，细胞接种后的前6 d生长较慢，6~16 d生长迅速，至19~21 d时细胞生长基本平稳。见图 2。

图 2 Caco-2细胞生长曲线图

细胞单层AP侧及BL侧的碱性磷酸酶含量随培养时间延长而增加，第21天两侧碱性磷酸酶含量的比值达3.8 : 1。见表 1。

表 1

表 1 Caco-2细胞AP侧与BL侧碱性磷酸酶含量的动态变化 （x±s，U/L）

表 1 Caco-2细胞AP侧与BL侧碱性磷酸酶含量的动态变化 （x±s，U/L）

EPA浓度为25、50 μmol/L时，细胞存活率较0 μmol/L组增加（P < 0.05），其中50 μmol/L EPA组的细胞存活率高于25 μmol/L组（P < 0.05）；EPA浓度为100、200 μmol/L时，细胞存活率随浓度增高而降低，并且均低于0浓度组和EPA 25 μmol/L组、50 μmol/L组，差异具有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。

表 2

表 2 不同浓度EPA作用后的细胞存活率 （x±s，%）

表 2 不同浓度EPA作用后的细胞存活率 （x±s，%）

EPA浓度为0、25、50、100、200 μmol/L时，细胞凋亡率分别为6.8%±0.9%、8.3%±0.9%、10.7%±2.0%、25.4%±1.8%、45.5%±1.3%，EPA浓度为25、50 μmol/L时，细胞凋亡率与0浓度组的差异无统计学意义（P > 0.05）；EPA浓度为100、200 μmol/L时，凋亡率随浓度而增加，均高于0浓度组（P < 0.05）。见图 3。

图 3 不同浓度EPA处理后的Caco-2细胞凋亡情况 Q2象限细胞为晚期凋亡和坏死细胞。

单独E.coli LF82处理6 h或12 h，Caco-2细胞的ZO-1 mRNA表达随处理时间延长而减少，均少于空白处理组（P < 0.05）。EPA 25、50 μmol/L干预联合LF82处理6 h或12 h，Caco-2细胞的ZO-1 mRNA表达随EPA浓度增加而增加，均高于单独LF82处理组（P < 0.05）；但ZO-1 mRNA表达不随LF82处理时间延长而变化（P > 0.05）。见图 4。

图 4 不同处理组Caco-2细胞的ZO-1 mRNA表达 a示与未处理的Caco-2细胞比较，P < 0.05；b示与单独LF82处理6 h组比较，P < 0.05；c示与EPA 25 μmol/L+LF82处理6 h组比较，P < 0.05；d示与单独LF82处理12 h组比较，P < 0.05；e示与EPA 25 μmol/L+LF82处理12 h组比较，P < 0.05。

单独LF82处理6 h、12 h组的TNF-α表达随处理时间延长而增加，均高于空白处理组（P < 0.05）。EPA 25、50 μmol/L干预联合LF82处理6 h或12 h，细胞上清中TNF-α的表达随EPA浓度增加而减少，均少于单独LF82处理组（P < 0.05）；但TNF-α表达不随处理时间延长而变化（P > 0.05）。见图 5。

图 5 不同处理组Caco-2细胞的TNF-α表达 a示与未处理Caco-2细胞比较，P < 0.05；b示与单独LF82处理6 h组比较，P < 0.05；c示与EPA 25 μmol/L+LF82处理6 h组比较，P < 0.05；d示与单独LF82处理12 h组比较，P < 0.05；e示与EPA 25 μmol/L+LF82处理12 h组比较，P < 0.05。

肠上皮细胞间的紧密连接是肠黏膜屏障的基础，其受损可引起肠壁通透性增高，肠腔内毒性物质及微生物进入黏膜组织和循环系统，导致免疫紊乱及炎症反应^[1]。

Caco-2细胞株来源于人结肠癌细胞，培养21 d后可形成发达的紧密连接、类小肠微绒毛结构及小肠刷状缘水解酶，能有效模拟肠黏膜屏障，被广泛作为肠黏膜屏障模型^[10]。本研究显示，培养19~21 d时，Caco-2细胞分裂已趋于饱和，细胞与细胞之间形成紧密连接；第21天的细胞单层AP侧及BL侧的ALP含量比值为3.8 : 1，接近文献报道的3 : 1。表明ALP已经聚集于刷状缘侧（AP侧），细胞单层出现了明显的极化现象，与体外肠上皮细胞极性相似，说明Caco-2细胞在培养21 d左右可用于模拟肠上皮细胞。

EPA可通过抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用，还能有效预防热休克诱导的肠黏膜屏障损伤^[8-11]。本研究显示，EPA浓度为25、50 μmol/L时，Caco-2细胞增殖呈浓度依赖性；而浓度为100、200 μmol/L时，Caco-2细胞增殖明显受抑；并且EPA浓度为100、200 μmol/L时细胞凋亡。说明小剂量EPA能诱导Caco-2细胞增殖，大剂量则诱导凋亡，可能与大剂量EPA的毒性有关。

ZO-1是第一个被确定的紧密连接相关蛋白，是紧密连接复合物中的支架蛋白，当ZO-1受到破坏，紧密连接的屏障功能随之受损^[12]。本研究结果显示，EPA处理组的ZO-1 mRNA表达量增高；而在EPA预处理96 h后加入LF82，ZO-1 mRNA的表达高于单独LF82处理组。说明EPA能有效预防LF82感染后肠上皮细胞紧密连接的损伤；并发现单独LF82干预后TNF-α的表达增高，而EPA联合LF82干预的TNF-α的分泌量降低，说明EPA能抑制LF82感染诱导的炎症因子分泌。

综上所述，EPA能有效预防E.coli LF82感染后肠上皮细胞紧密连接的破坏，抑制炎症因子的分泌，对肠黏膜屏障有一定的保护作用。