2017, Vol. 19
先天性胆汁酸合成障碍2型（congenital bile acid synthesis defect type 2, CBAS2），又称为原发性Δ4-3-氧固醇5β-还原酶缺陷病，是一种由AKR1D1基因突变引起的常染色体隐性遗传病[1]。其主要的临床表现为胆汁淤积性黄疸，脂肪、脂溶性维生素吸收障碍，血清转氨酶升高，但血清总胆汁酸和γ-谷氨酰转肽酶正常[1]。AKR1D1基因位于染色体7q32-33，全长42 kb，包含9个外显子，编码2.7 kb的mRNA分子，其蛋白质产物为含326个氨基酸的Δ4-3-氧固醇5β-还原酶[2-3]。该酶主要表达在肝细胞，作为一种NADPH依赖性酶，催化所有含3-氧-4烯结构的类固醇激素和胆汁酸前体的还原反应[2-4]。
AKR1D1基因分析是CBAS2确诊的可靠依据。迄今为止，国外文献已报道12种AKR1D1基因突变，包括2种移码突变，2种无义突变和8种错义突变[5-10]。2010年，Zhao等[10]首次在2位中国大陆患者中检测出AKR1D1基因突变，说明我国也存在CBAS2患者；但目前国内涉及本病的文献仅有3篇综述[11-13]，CBAS2的临床诊断和治疗经验尚需要进一步积累。本文报道1例CBAS2患儿的临床和AKR1D1基因突变特征，希望作为引玉之砖，为本病确诊提供分子依据，并为后续诊治研究提供参考。
1 资料与方法 1.1 病例介绍患儿，男，8个月4 d，因“全身皮肤、巩膜黄染7月余”入院。患儿生后约半个月开始出现皮肤、巩膜黄染，伴尿黄、陶土样大便，家属未予重视。生后1个月8 d时到当地医院就诊，查肝功能：总胆红素228.5 μmol/L，结合胆红素97.7 μmol/L，非结合胆红素130.8 μmol/L，丙氨酸氨基转移酶119 U/L，门冬氨酸氨基转移酶190 U/L，γ-谷氨酰转肽酶45 U/L。后复查肝功能仍异常，但病因不明（表 1）。3个月10 d时在另一医院行“腹腔镜探查+胆道探查+胆道造影+胆道冲洗+肝活检术”，肝脏病理活检示：肝细胞明显增大，可见大量多核巨肝细胞和明显淤胆，肝窦稍扩张充血，门管区小胆管和纤维组织轻度增生，呈胆汁淤积性肝炎病理改变（图 1）。诊断为“胆汁淤积性肝病”，并给予百佳力（无乳糖中链甘油三酯配方奶粉）喂养及口服“联苯双酯”等药物，黄疸逐渐减轻，但肝功能异常持续（表 1）。为进一步诊治而至我院儿科就诊。患儿自起病以来，精神、睡眠尚可，胃纳差，米糊或奶粉每日约600 mL，大便为黄色，小便正常，体重增长缓慢。
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表 1 患儿历次生化检查结果 |
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图 1 患儿肝脏组织学检查结果 （A~B：苏木精-伊红染色，C：免疫组化，D：Masson染色，×200）可见肝小叶结构絮乱，肝细胞胞质呈细颗粒样或“毛玻璃”状，可见多核巨细胞，肝细胞淤胆（A），同时细胞间质（A）和汇管区（B）有大量淋巴细胞浸润；CK8蛋白免疫组化染色显示汇管区边缘小胆管轻度增生（C）；而Masson染色显示汇管区和细胞间质纤维组织增生（D）。以上改变，符合胆汁淤积性肝炎病理特征。 |
患儿系第2胎第2产，出生胎龄40周，经阴道分娩出生，出生体重2.85 kg，身长47.0 cm，出生时无窒息史。父母体健，非近亲结婚。否认家族类似病史及传染病史。
体格检查：体重6.85 kg（ < -2 SD），身长65 cm（ < -3 SD），头围42 cm（ < -2 SD）。神志清楚，精神可，发育、营养差。全身皮肤、巩膜轻度黄染，无皮疹及皮下出血点，浅表淋巴结未触及肿大。前囟平软，大小约1 cm×1 cm。唇红，咽无充血，未见脓性分泌物。颈软，无抵抗，气管居中，胸廓对称，无明显畸形，三凹征（-），双肺呼吸音清，未闻及干、湿性罗音。心律齐，心音有力，未闻及病理性杂音。腹稍饱满，肝右肋下8 cm，质地中等，脾肋下未及，移动性浊音（-），肠鸣音正常。脊柱、四肢无畸形，肛门及外生殖器无异常。腹壁、膝腱和跟腱等生理反射可引出，克氏、布氏和巴氏征均阴性。
辅助检查：入院后查血常规大致正常。生化检查发现肝功能异常（表 1）。血清锌4.9 µmol/L（参考值11.47~25.5 µmol/L），25-(OH)D 5.89 ng/mL（参考值30~100 ng/mL）。
1.2 代谢性肝病组套二代测序用EDTA抗凝管收集患儿静脉血2 mL，并用Blood DNA Mini kit试剂盒（杭州新景生物试剂开发有限公司）提取患儿基因组DNA 5 μg。Covaris S2超声仪将基因组DNA打断至约150 bp片段长度，随后片段化DNA经末端补平修复，两端加A，连接adaptor，扩增和纯化后，与探针混于杂交体系中，建立含有与代谢性肝病相关基因（JAG1、NOTCH2、ATP8B1、ABCB11等249个基因）的全基因组文库。用液相捕获试剂盒（北京迈基诺基因科技股份有限公司）捕获上述目标基因文库，然后利用新一代测序仪HiSeq2500（Illumina公司，美国）进行高通量测序，得出数据后进行基因序列的生物信息学分析，找出致病基因并判断其突变性质。
1.3 Sanger测序验证根据二代测序检测结果，对患儿及其父母DNA标本AKR1D1突变基因进行Sanger测序验证。所用引物（表 2）根据AKR1D1基因的DNA序列使用Primer Premier 5.0软件设计，由北京迈基诺基因科技股份有限公司合成。聚合酶链反应体系为：2×Goldstar Buffer Mix 10 μL（北京康为世纪生物科技有限公司），上、下游引物各1 μL，DNA 1 μL，最后灭菌双蒸水7 μL至总体积为20 μL。反应条件为：95℃预变性10 min；随后分为4步，即第1步94℃变性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸45 s，共3个循环；第2步94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸45 s，共5个循环；第3步94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共10个循环；第4步94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共17个循环；最后再72℃延伸5 min。
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表 2 AKR1D1基因突变位点的Sanger测序引物 |
聚合酶链反应产物经琼脂糖凝胶电泳切胶纯化，由北京迈基诺基因科技股份有限公司测序。应用Chromas软件对测序结果进行分析，并应用DNAMAN软件与AKR1D1基因组参考序列进行比对（Ensemble Genome Browser: ENST00000122787）。突变的命名根据相关文献[14-15]。
1.4 生物信息学分析采用Human Splicing Finder（HSF, URL:http://www.umd.be/HSF3/）预测基因变异是否影响剪接，同时应用SWISS-MODEL软件（http://swissmodel.expasy.org/）分析变异前后AKR1D1蛋白质三级结构变化，推测基因变异影响蛋白质功能的可能机制。
本研究经暨南大学附属第一医院医学伦理委员会批准，并获得患儿父母签署书面知情同意书。
2 结果 2.1 遗传学分析结果代谢性肝病组套分析结果显示：患儿AKR1D1基因检测到2个突变，其中c.579+2delT为第5内含子的5' 端经典剪接位点的缺失突变，而c.853C > T(p.Q285X)为外显子7的无义突变（图 2）。Sanger测序验证证实，患儿为上述突变的复合杂合子，而其母亲和父亲分别为相应突变携带者（图 3）。
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图 2 患儿AKR1D1基因代谢性肝病组套分析结果 上图为c.579+2delT突变，红框内可见AKR1D1基因的编码区第579+2位的野生型胸腺嘧啶T部分缺失；下图为c.853C > T(p.Q285X)突变，红框内可见AKR1D1基因的编码区第853位的野生型胞嘧啶C部分突变为胸腺嘧啶T。 |
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图 3 患儿及其父母AKR1D1基因Sanger测序验证结果 患儿为c.579+2delT突变和c.853C > T(p.Q285X)突变的复合杂合子；父亲为c.853C > T(p.Q285X)突变携带者；母亲为c.579+2delT(Splicing)突变携带者。 |
查阅知网、万方、维普、美国Pubmed和人类基因突变数据库（human gene mutation database, HGMD），均未见AKR1D1基因c.579+2delT和c.853C > T(p.Q285X)突变的报道。HSF预测结果提示，c.579+2delT突变对野生型供体位点具有强破坏性，将产生新的剪接受体位点（野生型CV值为20.94，突变型CV值为71.9，ΔCV值为+243.36%），从而影响前体mRNA剪接，阻碍AKR1D1蛋白（Δ4-3-氧固醇5β-还原酶）的正常合成。SWISS-MODEL预测并构建野生型和突变型AKR1D1蛋白的三维结构，结果显示，突变c.853C > T导致AKR1D1蛋白翻译提前终止，致使突变型AKR1D1蛋白的三维结构缺失1个α-螺旋（图 4）。
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图 4 AKR1D1蛋白质三维结构模型 A：显示野生型Δ4-3-氧固醇5β-还原酶，B：显示c.853C > T(p.Q285X)突变发生后的Δ4-3-氧固醇5β-还原酶。与野生型Δ4-3-氧固醇5β-还原酶（A）相比，突变型（B）C端缺失了一个α-螺旋（红框中紫色部分）。 |
2.2 治疗与结局
因病程中总胆汁酸水平基本正常，患儿以“1.先天性胆汁酸合成障碍？2.维生素D缺乏症；3.锌缺乏症”收住儿科。根据患儿临床特点及基因分析结果，患儿胆汁淤积病因确定为CBAS2，予口服鹅脱氧胆酸，同时给予康普力星补锌，并补充罗盖全、维生素AD和E等脂溶性维生素治疗半个月，患儿肝肿大和肝功能逐渐改善后出院。出院后继续以上治疗，3个月门诊复查，体重7.8 kg（ < -2SD），身长69.5 cm（ < -2SD），头围44.5 cm（ > -2SD），黄疸完全消退，肝脏右肋下2.5 cm可及，质地软，且肝功能指标基本恢复正常。
3 讨论1988年Setchell等[16]首次报道了2例Δ4-3-氧固醇5β-还原酶缺陷病患儿。2003年，Lemonde等[5]提出AKR1D1基因突变为Δ4-3-氧固醇5β-还原酶缺陷病的病因，并将此病命名为CBAS2。研究发现酪氨酸血症1型[17]、新生儿血色沉着病[7, 18-19]和乙型肝炎[5]等疾病可继发Δ4-3-氧固醇5β-还原酶缺陷，与CBAS2鉴别困难。目前认为基因检测可用于确诊CBAS2，亦是鉴别CBAS2与继发性Δ4-3-氧固醇5β-还原酶缺陷病的唯一方法[7, 20]。本例患儿其主要临床表现为胆汁淤积性黄疸，伴有生长发育迟缓。多次生化检查发现血清转氨酶升高，总胆红素升高，且以结合胆红素为主，但γ-谷氨酰转肽酶和总胆汁酸基本正常。肝脏组织学检查示，肝小叶结构絮乱，肝细胞胞质呈细颗粒样或“毛玻璃”状，可见多核巨细胞，肝细胞内明显淤胆，间质和汇管区有大量淋巴细胞浸润，纤维组织和小胆管轻度增生。上述表现为典型CBAS2临床特点[1]，但仅根据临床特点仍无法明确具体病因。本研究行代谢性肝病组套分析结合Sanger测序验证后，发现患儿为AKR1D1基因突变的c.579+2delT及c.853C > T(p.Q285X)复合杂合子，前者为来自母亲的剪接位点突变，后者为父源性无义突变，为CBAS2确诊提供了实验依据。
Δ4-3-氧固醇5β-还原酶拥有一个具有催化活性的核心结构域，此结构域中包括NAD(P)(H)结合区、活性区和底物结合位点[21]。该酶在NADPH的辅助下，在核心结构域进行双键还原反应，负责催化C-4/C-5双键结合在Δ4-3-酮类固醇上形成A/B环交接点，使平面类固醇产生A/B cis环，最终使胆汁酸具有兼性亲水亲脂特征，能够发挥其乳化脂肪和胆固醇的生理功能[4, 21-22]。本研究患儿为AKR1D1基因无义突变c.853C > T导致AKR1D1蛋白截短，其三级结构缺失1个α-螺旋，致使该蛋白核心结构域中的部分NAD(P)(H)结合区受损，最终影响酶蛋白活性；而突变c.579+2delT为新的剪接位点突变，经HSF软件预测，可导致mRNA影响剪接异常，产生异常蛋白，从而阻碍AKR1D1蛋白的正常合成。
CBAS2患者发病的关键病理生理环节是Δ4-3-氧固醇5β-还原酶的上游胆汁酸中间代谢物蓄积，而下游正常胆汁酸产物合成不足。口服初级胆汁酸，包括胆酸和鹅去氧胆酸，不仅可以提供人体必需的初级胆汁酸，而且可通过负反馈作用抑制胆固醇7α-羟化酶的表达，从而抑制异常胆汁酸的合成，减少肝毒性胆汁酸中间代谢物的产生，故本病采用初级胆汁酸替代治疗，可改善肝功能，避免肝脏进一步损害[8, 23]。肝移植是经药物治疗无法控制病情患儿的唯一选择，目前为止，仅有1例患儿进行了肝移植，术后2年10个月随访，预后良好[5]。本例患儿口服鹅去氧胆酸后肝肿大和肝功能进行性改善，暂无肝脏移植指征，但其远期预后有待随访观察。
本文系统性分析了1例CBAS2患儿的临床症状、体征和实验室检查特点，确诊患儿为AKR1D1基因新突变导致的CBAS2，并通过鹅去氧胆酸治疗取得良好效果。本研究扩展了AKR1D1基因突变谱，并为患者分子诊断、家系遗传咨询及产前诊断提供了依据。
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