2. 天津市儿童医院呼吸科, 天津 300134;
3. 天津科技大学生物工程学院,天津 300457
在世界范围内,病毒感染是导致儿童呼吸道感染发病和死亡的重要原因之一[1]。目前为止,即使使用最先进的诊断技术,仍然只有50%的呼吸道病原可以被确定[2]。多瘤病毒属病毒含有双链DNA基因组,可以感染多种生物体,如禽类、啮齿动物和一些灵长类动物[3]。2007年之前,只有两种多瘤病毒,即BKV[4]和JCV[5],被证实可以导致人类疾病。2007年,美国华盛顿大学医学院的Gaynor等[3]在对2 135名儿童下呼吸道感染患者进行治疗时,发现其中的43名儿童体内存在一种新病毒,命名为“WU多瘤病毒(WUPyV)”,是最近从小儿下呼吸道感染分泌物中分离到的一种新的人多瘤病毒。同年,瑞典斯德哥尔摩卡洛琳斯卡学院的科学家Allander等[6]从637份小儿下呼吸道感染分泌物和192份粪便中鉴定出另一种新人多瘤病毒,命名为“KI多瘤病毒(KIPyV)”。尽管两种病毒紧密关联,但从氨基酸构成和系统进化分析显示,其本质是不同的[2]。通过对人群血清学调查表明,至成年后,KIPyV及WUPyV抗体阳性率可达70%~80%,证明人群可广泛感染这两种病毒[7]。研究显示,KIPyV及WUPyV与儿童急性呼吸道感染相关,且与其他多种呼吸道病毒及细菌存在较高的合并感染率[7-9],同时有学者报道免疫缺陷患儿更容易感染KIPyV及WUPyV[10]。虽然,KIPyV及WUPyV和BKV、JCV一样可以感染人类,但其致病机制及导致的临床症状尚不明确[11]。
本研究收集天津地区3年共3 730例急性呼吸道感染住院患儿鼻咽分泌物标本,进行KIPyV及WUPyV的分子生物学检测,分析病毒感染与季节、年龄、性别的关系、混合感染情况及外壳蛋白编码基因的进化特征,以对该地区KIPyV及WUPyV分子流行病学做初步研究,探讨KIPyV及WUPyV是否为天津地区儿童病毒病原谱的重要组成,并研究其与儿童急性呼吸道感染的关系。
1 资料与方法 1.1 研究对象收集2011年1月至2013年12月天津市儿童医院急性呼吸道感染住院患儿3 730例,其中男2 536例,女1 194例。年龄9 h至14岁。主要入院诊断为支气管炎、喘息性支气管炎、支气管肺炎、肺炎、喉炎,主要症状为咳嗽、喘息、发热、抽搐、腹泻。
1.2 标本采集采用一次性吸痰管吸取患儿鼻咽分泌物1~2 mL,置于含6~8 mL磷酸盐缓冲液(PBS)的离心管中充分混合。样本悬液于2 000 rpm离心10 min,收集细胞沉淀,取部分细胞做涂片,用于直接免疫荧光测定,剩余细胞立即于-80℃保存。采用直接免疫荧光测定法检测7种常见呼吸道病毒:流感病毒A、B型、副流感病毒1、2、3型、合胞病毒、腺病毒。试剂盒为D3 Ultra DFA Respiratory Virus Screening & ID Kit(美国Diagnostic Hybirds公司),操作按说明书进行。剩余标本立即冻于-80℃保存,用于KIPyV和WUPyV检测。
1.3 KIPyV及WUPyV PCR检测标本室温解冻后,采用TIANGEN DNA/RNA共提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取病毒核酸。采用巢式引物POLVP1-39F(AAGGCCAAGAAGTCAAGTTC)/POLVP1-363R(ACACTCACTAACTTGATTTGG)、POLVP1-118F(GTACCACTGTCAGAAGAAAC)/POLVP1-324R(TTCTGCCAGGCTGTAACATAC)扩增KIPyV的VP1基因[6]。反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,54℃退火1 min,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃继续延伸10 min。目的片段为207 bp。
初始检测WU病毒的PCR引物[3]为AG0044(TGTTACAAATAGCTGCAGGTCAA)和AG0045(GCTGCATAATGGGGAGT ACC)。反应条件:94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸60 s,运行40个循环。目的片段为250 bp。第2种确认引物为AG0048(TGTTTTTCAAGTATGTTGCATCC)和AG0049(CACCCAAAAGACACTTAAAAGA AA)。反应条件:94℃变性30 s,53℃退火40 s,72℃延伸60 s,运行50个循环。目的片段为244 bp。
PCR扩增试剂采用TIANGEN 2×Taq PCR Master Mix。反应体系为:2×Master Mix 12.5 μL,上游引物和下游引物各0.5 μL(10 μmol/L),DNA模板2 μL(第2次PCR反应模板为第1次PCR产物),余ddH2O补足至25 μL。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶(内含0.5 g/mL的溴化乙锭)电泳鉴定,以100 bp DNA标准带作为核酸片段长度参照标准。选取部分阳性PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.4 PCR产物的纯化、克隆与鉴定回收PCR产物(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,天根生化科技有限公司)后,与PUCm-T载体连接,转化E. coli DH5α感受态细胞。涂板后挑取筛选阳性菌落,提取质粒(质粒小提试剂盒,天根生化科技有限公司)并进行PCR和测序鉴定。
1.5 序列分析所测得的序列通过BLAST与GenBank中的KIPyV和WUPyV参考序列比对,利用MEGA5.0软件通过邻接法(neighbor-joining method, NJ法)绘制进化树,Bootstrap值基于1 000次重复。将克隆成功的基因进行序列测定和分析,并将核苷酸序列提交GenBank。
1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计学分析。计数资料以百分率(%)表示,不同月份检出率的比较采用χ2检验,P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 KIPyV筛查情况3 730例住院患儿中共有453例KIPyV PCR结果为阳性,总阳性率为12.14%。阳性产物的凝胶成像均在207 bp处出现单一条带。其中,男女患儿的阳性率分别为12.30%(312/2 536)和11.81%(141/1 194),差异无统计学意义(χ2=0.19,P=0.67)。2011年KIPyV阳性率为6.67%(85/1 274),其中男女患儿的阳性率分别为7.15%(60/839)和5.75%(25/435);2012年阳性率为17.06%(222/1 301),其中男女患儿的阳性率分别为17.23%(157/911)和16.67%(65/390);2013年阳性率为12.64%(146/1 155),其中男女患儿的阳性率分别为12.09%(95/786)和13.82%(51/369)。
2011年1月至2013年12月,KIPyV阳性检出率最高的月份为2013年6月(33.33%,32/96),其次是2012年4月(32.14%,32/112)和2012年9月(30.61%,30/98),见图 1。根据图 1中月份的平均感染率可以看出,6~7月阳性率明显偏高,这说明KIPyV感染多发于夏季。不同月份KIPyV阳性率总体上差异具有统计学意义(χ2=21.600,P < 0.01)。
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图 1 2011~2013年各月份KIPyV阳性检出率 |
2011~2013年453例KIPyV阳性患儿中位年龄为6个月,2011~2013年阳性患儿中位年龄分别为6.5、6、7个月。453例KIPyV阳性患儿中,年龄最大14岁,最小40 h。其中,96.03%(435/453)的阳性患儿年龄小于3岁,以6个月~年龄组的阳性检出率最高(12.60%,116/921)。不同年龄组患儿KIPyV的检出率比较差异无统计学意义(χ2=0.64,P=0.96)。见表 1。
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表 1 不同年龄组患儿鼻咽分泌物KIPyV检出情况[n(%)] |
2.2 WUPyV筛查情况
3 730例住院患儿中共有63例WUPyV PCR结果为阳性,总阳性率为1.69%。其中男女患儿的阳性率分别为1.81%(46/2 536)和1.42%(17/1 194),差异无统计学意义(χ2=0.74,P=0.39)。2011年WUPyV阳性率为2.20%(28/1 274),其中男女患儿的阳性率分别为2.26%(19/839)和2.07%(9/435);2012年阳性率为2.61%(34/1 301),其中男女患儿的阳性率分别为2.85%(26/911)和2.05%(8/390);2013年仅检出1例男性患儿,阳性率为0.09%(1/1 155)。
2011年1月至2013年12月,WUPyV阳性检出率最高的月份为2012年3月(12.00%,12/100),其次是2012年2月(7.35%,10/136)和2011年1月(6.00%,6/100),而2013年除8月外,其余月份的阳性率均为0,见图 2。由图 2可以看出不同年份WUPyV阳性率具有较大变化,从平均感染率可以看出2~3月份阳性率明显偏高,这说明WUPyV感染多发于春季。
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图 2 2011~2013年各月份WUPyV阳性检出率 |
2011~2013年WUPyV阳性患儿中位年龄为7.5个月(范围26 d至5岁),其中2011~2012年阳性患儿中位年龄分别为7个月、8个月,2013年仅检出1例阳性,患儿1岁。63例WUPyV阳性患儿中,62例(98.41%)的阳性患儿年龄小于3岁,以6个月~年龄组的阳性检出率最高(2.28%,21/921),但不同年龄组患儿WUPyV的检出率比较差异无统计学意义(χ2=5.28,P=0.26)(表 2)。
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表 2 不同年龄组患儿鼻咽分泌物WUPyV检出情况[n(%)] |
2.3 其他病毒筛查及混合感染情况
常见的7种呼吸道病毒在3 730份标本中的阳性率为15.52%(579/3 730)。以合胞病毒检出率最高;其次是副流感病毒3和副流感病毒1(表 3)。
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表 3 常见的7种呼吸道病毒感染情况[n(%)] |
同时,7种常见呼吸道病毒和KIPyV与WUPyV检测结果表明,KIPyV和WUPyV之间及与其他7种呼吸道病毒存在混合感染的情况,混合感染率为2.31%(86/3 730),其中2011年1.33%(17/1 274),2012年3.23%(42/1 301),2013年2.34%(27/1 155)。KIPyV和WUPyV混合感染共9例,其中2011年3例,2012年6例(表 4)。
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表 4 KIPyV和WUPyV间及与其他7种常见病毒间的混合感染情况(例) |
2.4 序列比对及进化分析
选取35份KIPyV阳性PCR产物(分别编号为TJK1-TJK35)进行测序,将所得序列提交NCBI与已知的KIPyV序列进行比对,结果显示其同源性为94%~100%,证明所获得的序列确为KIPyV基因片段。选取12份WUPyV阳性PCR产物(分别编号为TJW1-TJW12)进行测序,将所得序列提交NCBI与已知的WUPyV序列进行比对,结果显示其同源性为95%~100%,也证明所获得的序列确为WUPyV基因片段。
测序结果与已知序列利用MEGA5.0软件通过NJ法绘制进化树,Bootstrap值基于1 000次重复。结果显示,其中34份KIPyV阳性标本与澳大利亚Brisbane001(GenBank序列号:EF520287)、德国Wuerzburg/07(GenBank序列号:FJ647575)、法国Mpt1(GenBank序列号:AM849808)、泰国CU-258(GenBank序列号:EU358767)、意大利Rome(GenBank序列号:EU807841)、浙江温岭CLF-KI-F(GenBank序列号:EU433556)、兰州Lz386(GenBank序列号:EU678901)、北京BCH-151A(GenBank序列号:EU754875)、韩国KR-M-3209(GenBank序列号:EF639289)在同一基因进化簇主分枝中,另一阳性标本TJK16在同一侧枝上,而与瑞典Stockholm 60(GenBank序列号:EF127906)、德国KIV-FR688217(GenBank序列号:JN874415)稍远。
9份WUPyV阳性标本与北京WU BCH-GL5(GenBank序列号:EU684312)、韩国KR-M-2468(GenBank序列号:EF655822)、美国BO(GenBank序列号:EF444555)、浙江CLFF(GenBank序列号:EU277015)在同一基因进化簇主分枝中。另外3份阳性标本与美国WU Polymavirus(GenBank序列号:NC009539)、法国WU Mpt1(GenBank序列号:AM778536)在同一基因进化簇主分枝中。
3 讨论自2007年KIPyV及WUPyV被发现以来,许多国家都报道了呼吸道感染儿童中KIPyV及WUPyV的感染情况,但检出率及季节分布各地报道不一。已报道的KIPyV及WUPyV的阳性率分别为0.2%~5.3%[12-21]及1.1%~16.4%[3, 8, 10, 13-20, 22-23]。本研究结果显示KIPyV的阳性率为12.14%,明显高于其他国家和地区,但相关报道显示,天津地区常见呼吸道病毒的检出率低于其他地区[24],这也许是因为此类新型病毒的出现和传播干扰了其他传统病毒的流行规律,但需要进一步证实[25]。本组病例WUPyV的阳性率为1.69%,与意大利(1.4%)[8]、广东(1.95%)[7]、法国(2.4%)[10]、北京(2.4%)[26]的研究结果相似,但高于德国的检出率(0.4%)[27],低于湖南(5.0%)[28]、德国(4.9%)[23]、韩国(7%)[16]及日本(13.9%或16.4%)[9, 20]的检出率。
流行病学研究证实,KIPyV及WUPyV感染呈全年发病,但关于感染的高峰季节的报道不一。法国研究报道KIPyV只在1月流行,未发现WUPyV感染有明显的季节性[10];德国研究报道WUPyV高峰为冬季[23];意大利报道阳性病例集中在2004~2006年冬季和2007~2008年春季[8];韩国WUPyV最初发现者的研究表明,WUPyV在5~6月份阳性率最高,12月份也是一个小高峰[16]。日本Okada等[9]在为期两年的研究中显示,大多数感染发生在春季和夏初。中国广东WUPyV阳性率在2009年上半年明显高于下半年,且2月份最高[7]。而本研究结果显示KIPyV夏季阳性率最高,WUPyV春季阳性率最高。这提示KIPyV及WUPyV在不同地区的流行时间及高峰月份有不同,可能与研究时期和地理差异有关。
本研究中,KIPyV及WUPyV感染的阳性患儿年龄均主要集中在3岁内。法国学者在537名儿童中检测出3名KIPyV阳性患儿,年龄分别为10、18、30个月;WUPyV阳性患儿年龄在2个月至2岁间[12]。日本报道KIPyV阳性患儿的年龄主要集中在3个月至2岁11个月之间;WUPyV感染患儿年龄为1个月至4岁11个月[20]。中国北京报道415份患儿标本中检出2例KIPyV阳性,患儿年龄分别为3个月及3.5岁;WUPyV的易感儿童为2个月至7岁间,平均年龄25.4个月[26]。
在已有的多篇文献报道中,多瘤病毒可与多种病毒混合感染。KIPyV与其他病毒的混合感染率可高达74%,WUPyV与其他病毒的混合感染率为68%~79%[15-16, 29]。日本Teramoto等[20]的研究中多瘤病毒阳性标本存在与合胞病毒、偏肺病毒、鼻病毒、副流感病毒1和博卡病毒的混合感染,KIPyV及WUPyV与其他病毒的混合感染率分别为57.1%和47.4%。日本Okada等[9]的研究中所有KIPyV阳性标本均混合感染其他病毒,51%的WUPyV混合感染其他病毒和细菌。意大利的研究中8例多瘤病毒阳性标本中有4例分别混合感染合胞病毒和腺病毒[8]。菲律宾的研究中KIPyV阳性标本存在与合胞病毒、偏肺病毒和腺病毒的混合感染,感染率为75%;WUPyV阳性标本存在与合胞病毒、副流感病毒1和鼻病毒的混合感染,感染率为64%[30]。中国北京11例WUPyV阳性患儿中有6例混合感染鼻病毒、4例混合感染合胞病毒、3例混合感染副流感病毒、2例混合感染肺炎支原体[26]。中国汕头的研究结果显示,3例WUPyV阳性标本全都存在与其他病毒(鼻病毒、博卡病毒)的混合感染[31],韩国学者报道67.6%的WUPyV阳性标本存在其他病毒的混合感染[16]。本研究检出KIPyV与WUPyV存在与其他病毒的混合感染,但混合感染率低于以上报道,可能与本研究所检测的呼吸道病毒种类与之不同有关,也可能与各地区不同年份各呼吸道病毒的流行情况不同有关。
本研究利用系统发生分析表明,在核苷酸水平上,KIPyV与WUPyV与国内外流行株间差异较小,本研究测序结果与其他国内参考株序列在同一基因进化簇主分枝中,基因组相对稳定。KIPyV与WUPyV序列保守,与国外其他报道一致[12, 20, 26]。
综上所述,本研究在来自天津地区的呼吸道感染患儿中检测到KIPyV与WUPyV的阳性率分别为12.14%和1.69%,对天津地区儿童呼吸道感染病原谱做了重要补充。发现KIPyV和WUPyV感染具有一定季节性,有利于以后根据其季节流行特点进行重点监测。但由于KIPyV或WUPyV与其他病毒存在较高的混合感染率,很难确认患儿哪些临床表现是由KIPyV或WUPyV单独感染所导致。同时,由于KIPyV或WUPyV的既往文献多为2004~2009年的报道,而本研究的调查时段为近连续3年,由于新的呼吸道病毒不断出现,不同病毒的流行趋势可能发生变化,因此在病毒阳性率等方面本研究与既往文献报道有一定差异。本研究的不足之处在于所检测的呼吸道病毒种类有限,因此混合感染率低于其他国家。今后还应该收集患儿更详细的临床资料,对患儿临床表现、诊断及预后进一步研究,以便更客观地评价KIPyV或WUPyV的病原学作用。
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