肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, MP）是一种可导致呼吸道感染的病原体，引起上呼吸道感染、气管炎、社区获得性肺炎、慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病，影响支气管哮喘发作^[1]。部分患儿在感染MP后甚至出现全身性临床表现，如脑炎、心包炎、Crohn's病等^[2]。机体在抵御病原微生物感染过程中伴随着黏液的分泌，然而气道黏液过度分泌则可加重哮喘、COPD等疾病的病情。黏蛋白（mucin, MUC）5AC和MUC5B是黏液的重要组成部分，MP感染能够诱导气道上皮细胞MUC5AC和MUC5B的表达与分泌^[3-4]，然而具体作用机制有待研究阐明。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）是一种酪氨酸激酶受体，其介导的信号转导在MP感染中具有重要作用^[3]。膜联蛋白A2（annexin A2, AnxA2）是一种Ca²⁺依赖的磷脂结合蛋白，可调控EGFR信号转导及内吞作用，参与EGFR下游基因的活化^[5]。EGFR信号在细胞内转导常常导致信号分子核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的活化，而NF-κB则介导细胞促炎因子和黏蛋白的表达^[6-7]。因此本研究以MP为研究对象，探索AnxA2在MP抗原处理人气道上皮细胞后诱导MUC分泌的作用机制。

气道上皮细胞NCI-H292购自美国典型菌种保藏中心（ATCC），RPMI-1640培养基购自美国Invitrogen公司，MP购自首都儿科研究所，PPLO培养基购自青岛日水生物技术有限公司，Hanks平衡液、蛋白浓度测定试剂盒购自美国Sigma公司，十二烷基硫酸钠（SDS）、丙烯酰胺、PVDF膜购自江苏碧云天生物技术有限公司，BamⅠ、HindⅢ内切酶、Lipofectamine^TM 2000购自美国Thermo Fisher公司，pAVU6+27载体购自北京普如汀生物技术有限公司，MUC5AC、MUC5B试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂购自大连宝生物工程有限公司，AnxA2抗体、p65 NF-κB抗体、p-p65 NF-κB抗体、EGFR抗体、p-EGFR抗体、β-actin辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Abcam公司。

将人气道上皮细胞NCI-H292培养于含有10% FBS的RPMI-1640培养基中，培养基中同时加入100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，置于5%、37℃恒温培养箱中培养。

将MP接种于配制好的含20%马血清的PPLO培养基中，并置于5%、37℃恒温培养箱中培养。MP生长至对数期时，收集培养物并加入Hanks平衡液，14 000 r/min离心20 min，重复操作2次。收集离心后沉淀物置于超声仪中超声6~8次，超声时间持续1 min。将超声后的产物以14 000 r/min离心5 min，离心结束后取上清并弃沉淀，蛋白浓度测定试剂盒测定MP抗原浓度。

收集生长至对数期H292细胞悬液，细胞计数后接种于96孔板中，每孔细胞约5×10⁴个。将细胞随机分为对照组、MP组、NC-siRNA+MP组和AnxA2 siRNA+MP组，每组10个复孔。对照组细胞利用PBS溶液处理，MP组细胞利用5μg/mL MP抗原刺激2 h，NC-siRNA+MP组和AnxA2 siRNA+MP组细胞分别转染NC-siRNA和AnxA2 siRNA 24 h后用MP抗原刺激2 h。

由AnxA2的基因序列（NC_000015.10）设计出含有BamⅠ和HindⅢ酶切位点的siRNA引物序列，上游引物：5'-GATCCGACA-GAGTTCCTAAGCTTCTTCAAGACGGAAGCTTA-GGAACTCTGTCTTTTTTGTCGACA-3'，下游引物：3'-GCTGTCTCAAGGATTCGAAGAAGTTCTGCCTTC-GAATCCTTGAGACAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5'，片段长度65 bp，序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。将扩增产物克隆到shRNA质粒pAVU6+27中，测序、鉴定重组质粒。将H292细胞接种到24孔培养板中，取5 μL Lipofectamine^TM 2000稀释到250 μL减血清MEM培养基中，加入细胞培养孔，轻轻混匀，室温孵育5 min；每孔再加入8 μL siRNA，室温孵育20 min。取50 μL siRNA-Lipofectamine复合物加入到细胞培养孔中，轻轻摇动混匀，37℃、5% CO₂条件下培养。

各组细胞分别在转染后1、2、3、4 d弃去上清液，PBS清洗，每孔加入MTT 100 μL（终浓度为0.15 mg/mL），置于37℃、5%CO₂培养箱内继续孵育4~6 h，加入10%十二烷基硫酸钠与50%异丙醇（100 μL/孔）助溶。37℃、5%CO₂放置过夜后于全自动酶标仪490 nm波长处测定OD值。实验独立重复3次，取平均数作为实验结果。

使用RNA提取试剂盒提取H292细胞中总RNA，将其反转录成cDNA后作为模板扩增基因片段。AnxA2上游引物：5'-CCAGAACCAACCAGGAGC-3'，下游引物：5'-CTTGCGGAAGTCACCAGA-3'。PCR扩增体系（20 μL）：上、下游引物各0.5 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，模板2 μL，ddH2O 7 μL。反应条件：95℃ 2 min；94℃ 20 s，60℃ 20 s，40个循环，溶解曲线温度65~95℃。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后染色、拍照。目的基因和β-actin基因的拷贝数分别根据产生的Ct值从各自的标准曲线获得，用目的基因的拷贝数除以β-actin的拷贝数作为靶基因的相对表达量。实验独立重复3次，取平均数作为实验结果。

H292细胞分组处理后经反复冻融、裂解细胞。将裂解物经1 000 r/min离心5 min，弃沉淀，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测上清中MUC5AC和MUC5B的含量。实验严格按照试剂盒提供的操作步骤进行，实验独立重复3次。

收集各组H292细胞，利用RIPA裂解缓冲液裂解细胞并提取细胞总蛋白。在常温下用12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳分离蛋白，半干法将分离后的蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST室温下水平摇床慢摇封闭1 h。封闭结束后，用一抗AnxA2抗体（稀释度1 : 300）、p65 NF-κB抗体（稀释度1 : 500）、p-p65 NF-κB抗体（稀释度1 : 500）、EGFR抗体（稀释度1 : 500）、p-EGFR抗体（稀释度1 : 500）在4℃环境中孵育过夜。一抗孵育结束，漂洗，随后用辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释度1 : 10 000）室温下孵育1 h。利用ECL显色试剂盒显色，暗室环境负片成像，以β-actin为内参进行定量分析，Image J软件分析各条带光密度值。结果以目的条带光密度值/β-actin光密度值计算相对表达量。实验独立重复3次。

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组均数的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法，P < 0.05为差异有统计学意义。

与对照组比较，MP组和NC-siRNA+MP组细胞活性明显降低（P < 0.05），AnxA2 siRNA+MP组细胞活性均高于MP组和NC-siRNA+MP组，但仍低于对照组（P < 0.05），NC-siRNA+MP组细胞活性与MP组比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图 1，表 1。

图 1 MTT法检测各组H292细胞活性（n=3）

表 1

表 1 各组H292细胞活性比较（x±s，n=3）

表 1 各组H292细胞活性比较（x±s，n=3）

AnxA2 siRNA+MP组AnxA2 mRNA及蛋白水平明显低于对照组、MP组和NC-siRNA+MP组（P < 0.05），对照组、MP组和NC-siRNA+MP组AnxA2 mRNA及蛋白水平组间两两比较差异均无统计学意义（P > 0.05），见图 2~3。

图 2 实时荧光定量PCR检测各组H292细胞AnxA2 mRNA表达（n=3） a示与对照组比较，P＜0.05；b示与MP组比较，P＜0.05；c示与NC-siRNA+MP组比较，P＜0.05。

图 3 Western blot检测各组H292细胞AnxA2蛋白表达 上图为蛋白电泳条带图，下图为统计图（n=3）。a示与对照组比较，P＜0.05；b示与MP组比较，P＜0.05；c示与NCsiRNA+MP组比较，P＜0.05。

MP组与NC-siRNA+MP组细胞中p-EGFR和p-p65 NF-κB的表达水平比较差异均无统计学意义（P > 0.05），但均高于对照组（P < 0.05）；AnxA2 siRNA+MP组细胞中p-EGFR和p-p65 NF-κB的表达水平低于MP组和NC-siRNA+MP组（P < 0.05）；各组细胞中EGFR和p65 NF-κB表达水平比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图 4~5。

图 4 Western blot检测各组H292细胞p-EGFR和p-p65 NF-κB蛋白表达电泳图

图 5 Western blot检测各组H292细胞p-EGFR和p-p65 NF-κB蛋白表达统计图（n=3） a示与对照组比较，P＜0.05；b示与MP组比较，P＜0.05；c示与NC-siRNA+MP组比较，P＜0.05。

MP组和NC-siRNA+MP组细胞中MUC5AC和MUC5B蛋白表达水平均显著高于对照组（P < 0.05）；AnxA2 siRNA+MP组细胞中MUC5AC和MUC5B蛋白的表达则明显低于MP组和NC-siRNA+MP组，但仍高于对照组（P < 0.05）；MP组和NC-siRNA+MP组细胞中MUC5AC和MUC5B蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。

表 2

表 2 各组H292细胞MUC5AC和MUC5B蛋白表达比较（x±s，%，n=3）

表 2 各组H292细胞MUC5AC和MUC5B蛋白表达比较（x±s，%，n=3）

作为一种膜结合蛋白，AnxA2广泛参与膜转运及膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动，包括胞吐作用中的膜融合、囊泡运输、细胞黏附、细胞增殖、凋亡、复制、信号转导以及离子通道的形成^[8]。目前，AnxA2在气道上皮细胞中作用已被越来越多的研究报道。Patchell等^[9]发现气道上皮细胞受到机械损伤后，AnxA2的表达上升并发生糖基化，参与细胞损伤修复。敲除AnxA2可诱导支气管上皮细胞凋亡和去黏附并抑制胶原蛋白VI的分泌^[10]。另外，研究也发现AnxA2分子参与MP感染的致病过程，MP释放的毒素可通过AnxA2感染人体细胞并内化毒素、诱导细胞空泡化^[11]。本研究利用特异性siRNA沉默气道上皮细胞H292中AnxA2的表达，结果发现抑制AnxA2表达可提高MP抗原处理后的细胞活性，揭示了AnxA2可能参与MP抗原处理对上皮细胞活性的影响。然而，MP抗原处理的气道上皮细胞中AnxA2表达水平较对照组并无显著变化，显示出MP抗原处理并不直接通过影响AnxA2的表达来影响细胞存活及细胞病变。

EGFR是一种受体酪氨酸激酶，可与配体结合磷酸化，进而起始信号转导引发细胞变化，包括调控基因表达、重构细胞骨架、抑制细胞凋亡和增加细胞增殖等^[12]。EGFR信号通路在MP感染后细胞病变中具有关键性作用。MP感染可促进小鼠肺脏组织中EGFR磷酸化和MUC分泌，利用EGFR活性抑制物AG1478预处理则降低MUC的表达^[13]。MP抗原在体外也可上调支气管上皮细胞表皮调节素（EGFR配体之一），进而活化EGFR并诱导细胞IL-8表达^[14]。本研究发现MP抗原处理上调气道上皮细胞中p-EGFR和p-p65 NF-κB的表达水平，利用AnxA2 siRNA抑制细胞膜联蛋白表达后，p-EGFR和p-p65 NF-κB的表达水平明显下降，说明AnxA2分子介导MP抗原处理后EGFR/NF-κB信号通路的活化。本研究中，MP抗原处理上调细胞中MUC5AC和MUC5B的表达，而沉默AnxA2表达后，MUC的表达量明显降低，说明AnxA2分子参与MP抗原处理诱导细胞MUC的表达。有研究发现AnxA2受中性粒细胞弹性蛋白酶调控，由细胞质向细胞膜聚集，可促进支气管上皮细胞中MUC5AC的分泌^[15]，与本研究结论一致。由于本研究未能调控细胞系中EGFR的活性，因而不能直接说明MP是否通过AnxA2/EGFR/NF-κB信号上调MUC5AC和MUC5B的表达。

综上所述，本研究发现沉默气道上皮细胞AnxA2表达抑制MP诱导的EGFR/NF-κB信号活化以及MUC表达，揭示了AnxA2可能是参与MP抗原处理后气道上皮细胞病变的重要分子。