手足口病（hand, foot and mouth disease, HFMD）是由柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）、肠道病毒71型（enterovirus71, EV71）等肠道病毒引起的急性传染病，大多数为自限性、预后良好；少数出现脑炎、脑脊髓炎、肺水肿、循环障碍的HFMD多为EV71感染，致死原因主要为脑干脑炎及神经源性肺水肿^[1]，但具体机制尚未完全阐明。S100B是一种酸性钙结合蛋白，与中枢神经系统感染、癫癎、急性缺血性脑卒中等多种中枢神经系统疾病的发生发展密切相关^[2-4]。而且S100B基因多态性与许多中枢神经系统疾病的易感性、疾病进展及预后明显相关^[5-6]。但S100B基因多态性与EV71感染所致HFMD的相关性未见报道。本研究检测健康儿童和EV71感染HFMD患儿S100B基因rs9722位点基因多态性及表达水平，探讨S100B基因多态性在发病机制中的作用及意义。

选取2011年10月至2015年9月期间青岛市妇女儿童医院诊断并治疗的EV71感染（咽拭子或大便标本EV71荧光定量RT-PCR检测阳性）所致的HFMD患儿124例作为研究对象，既往无癫癎、脑瘫或运动、精神发育落后等；选取同期健康体检儿童56例作为对照组，其中男30例、女26例，年龄25±10个月。124例HFMD患儿中男75例、女49例，年龄22±11个月，其中80例为普通HFMD、44例为重症HFMD。对照组与HFMD患儿性别构成比（χ²=0.036，P=0.85）及年龄的差异（t=1.31，P=0.19）无统计学意义。HFMD诊断及分型符合手足口病诊疗指南（2010年版）^[1]。疗效判断参照文献^[7]，124例中118例痊愈，预后不良6例：包括住院过程中死亡、放弃治疗后死亡以及3个月内仍有严重神经系统后遗症的患儿。本研究获得医院伦理委员会批准及受试者家属知情同意。

选取位于S100B基因的第三个外显子单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNP）rs9772位点测序，用Premier Primer 5.0软件设计引物（北京六合华大基因科技有限公司合成），序列如下：S100B-F GCATTGTGGAAAGGCACG，S100B-RAAAGAGCAGGAGGTTGTGGAC，扩增产物长度为147 bp。

入院后立即采集静脉血2 mL（EDTA抗凝），-20℃储存。提取基因组DNA，测定DNA浓度后-20℃冰箱保存。PCR反应体系为dNTP 2.0 μL，10×rTaq buffer 3 μL，Forward Primer 1.0 μL，Reverse Primer 1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，rTaq 0.2 μL，ddH2O 20.8 μL，总体积30.0 μL。PCR反应条件为预变性95℃ 5 min，变性95℃ 30 s，退火56℃ 45 s，延伸72℃ 1 min，37个循环；终末延伸：72℃ 10 min，12℃ forever。PCR产物纯化、测序，反应体系为DNA 2.0 μL，Primer 1.0 μL，Bigdye 2.0 μL，DMSO 1.0 μL，总体积6.0 μL；测序反应条件为95℃ 2 min，95℃ 30 sec，55℃ 30 s，60℃ 90 s，共30个循环；12℃ forever。由华大基因提供测序服务。

74例患儿入院第1天采集外周静脉血3 mL，室温静置30 min，离心3 000 rpm×15 min，收集血清，-20℃保存待测。血清S100B检测按照试剂盒（上海恒远生物科技有限公司）说明书进行。

采用SPSS 19.0软件进行数据处理。采用基因计数法计算基因频率，基因型频率和等位基因频率，组间比较用χ²检验。研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度用χ²检验或Fisher确切概率检验。正态分布的计量资料用均数士标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

S100B基因rs9722位点测序结果（图 1）与Genebank中检索出的人S100B DNA序列一致，检出3种基因型：CC型（GTAACAGAGA[C/C]GGTCATGCAA）、CT型（GTAACAGAGA[C/T]GGTCATGCAA）和TT型（GTAACAGAGA[T/T]GGTCATGCAA）。S100B基因rs9722位点基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ² < 3.84，P > 0.05），表示资料代表性好。

图 1 S100B基因rs9722位点PCR产物测序结果 左图为CC基因型，中图为CT基因型，右图TT基因型。突变位点如箭头所示。

与对照组比较，HFMD组S100B基因rs9722位点TT基因型频率和T等位基因频率均明显增高，见表 1。重症HFMD患儿的TT基因型频率和T等位基因频率明显高于普通型患儿，见表 2。

表 1

表 1 对照组与HFMD组S100B基因rs9722位点多态性分布[例（%）]

表 1 对照组与HFMD组S100B基因rs9722位点多态性分布[例（%）]

表 2

表 2 普通HFMD与重症HFMD患儿S100B基因rs9722位点多态性分布[例（%）]

表 2 普通HFMD与重症HFMD患儿S100B基因rs9722位点多态性分布[例（%）]

与痊愈组比较，HFMD不良预后组患儿S100B基因rs9722位点TT基因型频率和T等位基因频率均明显增高（P < 0.05），见表 3。

表 3

表 3 手足口病患儿不同预后组S100B基因rs9722位点多态性分布[例（%）]

表 3 手足口病患儿不同预后组S100B基因rs9722位点多态性分布[例（%）]

74例初发HFMD患儿各基因型的血清S100B蛋白水平差异有统计学意义，以TT基因型最高，CC型最低，见表 4。

表 4

表 4 手足口病患儿S100B基因rs9722位点各基因型血清 S100B 蛋白水平（x±s，μg/L）

表 4 手足口病患儿S100B基因rs9722位点各基因型血清 S100B 蛋白水平（x±s，μg/L）

S100B属于S100家族的一员，分子量小，活性最强，基因定位于21号常染色体长臂2区2带，含有3个外显子和2个内含子。S100B蛋白是星形胶质细胞释放的神经营养因子，但高浓度有神经毒性作用，可通过刺激致炎因子表达导致细胞凋亡，并通过一氧化氮依赖途径诱导神经元细胞死亡，其过量表达与急性脑损伤有直接关系^[8-11]。与一些脑损伤常用标志物如脑型肌酸激酶、髓鞘碱性蛋白、神经元烯醇化酶等比较，S100B蛋白被认为是最能反映脑损伤程度及预后的标志物^[12-13]。

EV71属无包膜小RNA病毒，具有高度嗜神经性，最易侵犯脑干，导致循环不稳定及神经源性肺水肿。张乐海等^[14]研究发现，合并脑炎与未合并脑炎的手足口病患儿EV71 VP1区基因型的差异无统计学意义，提示HFMD病情与个体差异有关。Zou等^[15]研究显示，Ⅰ型干扰素受体启动子（IFNAR1）rs2843710位点基因多态性与EV71感染HFMD的易感性和严重程度相关。Li等^[16]研究显示，白介素-4 -589C/T基因多态性是汉族儿童EV71感染性疾病进展的重要原因。而最能反映脑损伤程度及预后的S100B蛋白，其基因多态性是否与EV71感染HFMD发生发展有关，尚未见报道。

本研究发现，EV71感染HFMD患儿S100B基因rs9722位点TT基因型频率和T等位基因频率均明显高于对照组，提示T等位基因可能是EV71感染所致HFMD的高危宿主因素。而且，重症患儿TT基因型频率和T等位基因频率均高于普通患儿；与痊愈组比较，HFMD不良预后组患儿的S100B基因rs9722位点TT基因型频率和T等位基因频率也增高，提示TT基因型感染EV71更易发展为重症HFMD，有临床预警意义。74例初发HFMD患儿各基因型的血清S100B蛋白水平以TT基因型最高，CC型最低，提示S100B基因rs9722位点TT基因型转录水平较高。

综上所述，本研究从基因水平揭示了S100B基因多态性对EV71感染HFMD的发生发展及预后的作用，也表明CT和TT基因型可影响EV71感染HFMD患儿S100B水平，为进一步明确HFMD发病机制提供了线索，为其治疗提供了新的靶点。但同时本研究也存在一定的局限性，如样本量较小，以及性别、环境、病情等因素未进一步分层，这也是今后继续研究的方向。