中国当代儿科杂志  2017, Vol. 19 Issue (9): 968-974   PDF    
微绒毛包涵体病一家系临床特点和MYO5B基因突变分析
程映1, 梁红2, 蔡娜莉3, 郭丽1, 黄宇戈3, 宋元宗1    
1. 暨南大学附属第一医院儿科, 广东 广州 510630;
2. 广州市妇女儿童医疗中心新生儿科, 广东 广州 510623;
3. 广东医科大学附属医院儿童医学中心, 广东 湛江 524001
通信作者: 宋元宗, 男, 教授, 主任医师。
摘要: 微绒毛包涵体病(MVID)是MYO5B或STX3基因突变导致的一种常染色体隐性遗传病,以难治性腹泻和营养吸收障碍为主要临床表现。本文探讨1例MVID患儿的临床特征及MYO5B基因突变特点。患儿为21 d女婴,因"解稀便20 d"收住院。体查发现患儿体重和身长落后,皮肤巩膜黄染;双肺呼吸音清,心音有力;腹部膨隆,腹壁静脉显露,肝脾肋下未触及。血生化结果发现总胆汁酸、胆红素、转氨酶、谷氨酰转肽酶等指标均升高,而血钠、氯、磷和镁水平均降低。血气分析提示代谢性酸中毒。初步诊断先天性腹泻,给予肠外营养及对症支持治疗。患儿腹泻顽固,代谢性酸中毒和电解质絮乱难以纠正,且转氨酶、谷氨酰转肽酶、总胆汁酸、胆红素等胆汁淤积指标持续高于正常。住院1月余自动出院,出院后失访。遗传学分析在患儿MYO5B基因检测到c.1966C > T(p.R656C)和c.310+2Tdup两个突变,分别来源于其母亲和父亲;其中c.310+2Tdup为新的剪接位点突变,最终患儿确诊为MVID。
关键词微绒毛包涵体病     MYO5B基因     腹泻     剪接位点突变     新生儿    
Clinical features and MYO5B mutations of a family affected by microvillus inclusion disease
CHENG Ying1, LIANG Hong2, CAI Na-Li3, GUO Li1, HUANG Yu-Ge3, SONG Yuan-Zong1     
Department of Pediatrics, First Affiliated Hospital, Jinan University, Guangzhou 510630, China
Corresponding author: Song Y-Z, Email:songyuanzong@vip.tom.com
Abstract: Microvillus inclusion disease (MVID) is an autosomal recessive disorder caused by biallelic mutations in the MYO5B or STX3 gene. Refractory diarrhea and malabsorption are the main clinical manifestations. The aim of this study was to investigate the clinical features and MYO5B gene mutations of an infant with MVID. A 21-day-old female infant was referred to the hospital with the complaint of diarrhea for 20 days. On physical examination, growth retardation of the body weight and length was found along with moderately jaundiced skin and sclera. Breath sounds were clear in the two lungs and the heart sounds were normal. The abdomen was distended and the veins in the abdominal wall were observed. The liver and spleen were not palpable. Biochemical analysis revealed raised serum total bile acids, bilirubin, transaminases and γ-glutamyl transpeptidase while decreased levels of serum sodium, chloride, phosphate and magnesium. Blood gas analysis indicated metabolic acidosis. The preliminary diagnosis was congenital diarrhea, and thus parenteral nutrition was given along with other symptomatic and supportive measures. However, diarrhea, metabolic acidosis and electrolyte disturbance were intractable, and the cholestatic indices, including transaminases, γ-glutamyl transpeptidase, bilirubin and total bile acids, remained at increased levels. One month later, the patient was discharged and then lost contact. On genetic analysis, the infant was proved to be a compound heterozygote of the c.310+2Tdup and c.1966C > T(p.R656C) variants of the gene MYO5B, with c.310+2Tdup being a novel splice-site mutation. MVID was thus definitely diagnosed.
Key words: Microvillus inclusion disease     MYO5B gene     Diarrhea     Splice-site mutation     Newborn infant    

微绒毛包涵体病(microvillus inclusion disease, MVID, OMIM #251850),又称为先天性微绒毛萎缩,是一种常染色体隐性遗传病,常表现为难治性水样腹泻、营养吸收障碍和生长发育迟缓[1-3]。MVID可分为早发型和迟发型,分别表现为出生后第1天和生后3~4月出现症状[4-5]。Davidson等[3]在1978年首次报道MVID,随后由Cutz等[1]命名。近年研究表明,90%的MVID由编码Vb型肌球蛋白的MYO5B基因突变导致,其余由编码突触融合蛋白的STX3基因突变导致[6]。目前国内外尚无关于本病的流行病学数据。我国学者虽有MYO5B基因突变与胆汁淤积或精神分裂有关的研究发现[7-8],但迄今国内文献中仅有1篇关于该基因突变导致MVID的论著[9]。本研究报道1例经遗传学分析确诊MVID患儿的诊治经过,为本病确诊提供遗传学依据,并为后续诊治研究提供参考。

1 资料与方法 1.1 病例介绍

患儿,女,21 d,因“解稀便20 d”入院。患儿生后2 d开始解稀便,7~10次/d,量少,伴腹胀;生后7 d仍有腹胀腹泻,并出现气促、精神反应差,遂至当地医院住院治疗。胃肠超声示:右侧腹部局部肠管稍扩张,腹腔肠管蠕动较快;血气分析示:代谢性酸中毒(表 1)、电解质紊乱(表 2);生化检查示:总胆红素、直接胆红素和胆汁酸等指标升高,提示胆汁淤积性黄疸(表 3);尿常规示:尿蛋白+、白细胞+、亚硝酸盐+、葡萄糖2+、酮体+、尿胆红素2+、潜血+、尿酸碱度6.0、尿比重1.020;血遗传代谢病筛查结果示:多种氨基酸增高。期间给予蒙脱石散止泻,枯草杆菌二联活菌和布拉氏酵母菌调节肠道功能,熊去氧胆酸利胆,更换无乳糖强化中链脂肪酸奶粉喂养,调节电解质平衡及静脉营养等治疗,共住院20 d,肝功能和酸中毒均未见明显改善。为明确病因遂至我科就诊。

表 1 患儿血气指标的动态改变

表 2 患儿历次电解质检查结果

表 3 患儿历次生化检查结果

患儿系第3胎第2产,出生胎龄39周,经阴道分娩出生,出生时羊水Ⅲ°混浊,无缺氧窒息史,1 min、5 min、10 min Apgar评分均为10分,脐带胎盘、胎膜无异常。出生体重2.85 kg。父母体健,非近亲结婚,否认家族类似病史及传染病史。

体格检查:体重2.2 kg(< -3 SD),身长45 cm(< -2 SD),头围33 cm。神志清醒,反应差,营养不良貌。皮肤、巩膜黄染,皮下脂肪2 mm,无皮疹及皮下出血点。前囟平软,大小约0.5 cm×0.5 cm。颈软,双锁骨触诊连续,双肺呼吸音清,未闻及干、湿性罗音。心律齐,心音有力,未闻及病理性杂音。腹软,脐部干洁,腹部膨隆,腹部静脉显露,最大腹围为33 cm,经脐腹围31 cm,腹部无包块。肝脾肋下未触及。移动性浊音(-),肠鸣音正常。脊柱、四肢无畸形,肛门及外生殖器无异常。腹壁、膝腱和跟腱等生理反射可引出,克氏、布氏和巴氏征均阴性。

辅助检查:入院后查血常规大致正常。生化检查发现电解质紊乱(表 2),同时胆汁酸、胆红素、转氨酶、谷氨酰转肽酶等胆汁淤积指标均升高(表 3)。血清锌5.70 µmol/L(参考值11.47~25.50 µmol/L)。

1.2 二代测序技术

采集患儿及其父母的EDTA抗凝外周血2 mL,按照Blood DNA Mini kit试剂盒(杭州新景生物试剂开发有限公司)说明书提取基因组DNA。将基因组DNA打断,建立含有与消化系统相关基因(NEUROG3、SLC26A3、EPCAM、CTLA4、MYO9B、BSND、APC和MYO5B等共54个基因)的全基因组文库,并对文库样本进行定量,保证文库样本总量在3 µg以上。上述目标基因均用液相捕获试剂盒(北京迈基诺基因科技股份有限公司)捕获,利用新一代测序仪IlluminaHiSeq2000(美国Illumina公司)进行高通量测序。测序平均深度不小于200(乘数),获得原始数据,进行详细的基因序列生物信息学分析,找出相关基因的所有突变信息,同时判断是否具有致病性。

1.3 Sanger测序验证

根据二代测序技术检测结果,对患儿及其父母基因组DNA进行Sanger测序,验证MYO5B基因突变。根据MYO5B基因序列(Ensemble Genome Browser: ENSG00000167306),运用Primer Premier 5.0软件设计引物(表 4),由北京迈基诺基因科技股份有限公司合成。聚合酶链反应体系包含2×Goldstar Buffer Mix(北京康为世纪生物科技有限公司)10 μL,上下游引物(10 μM)各1 μL,DNA 1 μL,加灭菌双蒸水7 μL至反应体系为20 μL。扩增条件为:95℃预变性10 min;随后分为4步,即第1步94℃变性30 s,64℃退火30 s,72℃延伸45 s,共反应3个循环;第2步94℃变性30 s,62℃退火30 s,72℃延伸45 s,共反应5个循环;第3步94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸45 s,共反应10个循环;第4步94℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸45 s,共反应17个循环;最后再72℃延伸5 min。聚合酶链反应产物纯化后,由北京迈基诺基因科技股份有限公司进行Sanger测序。

表 4 MYO5B基因突变位点的Sanger测序引物

1.4 生物信息学分析

应用Chromas和DNAMAN软件对测序结果进行分析,并采用Human Splicing Finder(http://www.umd.be/HSF3/)、MaxEntScan(http://genes.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscan_scoreseq.html)、NNSplice(http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)和NetGene2(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2)等在线软件工具,预测剪接位点变异是否影响前体mRNA剪接。

本研究经暨南大学附属第一医院医学伦理委员会批准,并请患儿父母签署书面知情同意书。

2 结果 2.1 遗传学分析结果

二代测序技术分析消化系统相关的54个基因,在患儿MYO5B基因上检测到两个突变c.1966C > T(p.R656C)和c.310+2Tdup(图 1~2)。Sanger测序结果证实,患儿为上述突变的复合杂合子,而父母分别为以上突变的携带者(图 3)。前一个突变引起MYO5B蛋白(Vb型肌球蛋白)第656位氨基酸残基由精氨酸变为半胱氨酸,是国外文献已报道的致病性突变[10]。经检索中国知网、万方、维普和Pubmed等文献数据库,以及人类基因突变数据库(human gene mutation database, HGMD)和千人基因组计划人群数据库,证实c.310+2Tdup为未报道过的新突变。生物信息学预测结果提示,该突变对野生型供体位点具有强破坏性,同时产生了新的剪接供体位点(野生型CV值为33.94,突变型CV值为76.01,ΔCV值为+ 123.95%),从而影响前体mRNA剪接,阻碍MYO5B蛋白的正常合成。另外,MaxEntScan、NNSplice和NetGene2软件预测野生型剪接位点得分分别为10.65、1.00和0.99;而突变型剪接位点得分分别为-0.66、0.93和0.55;均提示该突变可能影响前体mRNA剪接。

图 1 MYO5B基因c.1966C > T突变的二代测序技术分析结果 箭头所指为MYO5B基因模板链第1966位点野生型鸟嘌呤G部分突变为腺嘌呤A(c.1966C > T)。

图 2 MYO5B基因c.310+2Tdup突变的二代测序分析结果 箭头所指为MYO5B基因模板链第310+2野生型腺嘌呤A部分重复(c.310+2Tdup)。

图 3 患儿及其父母MYO5B基因突变的Sanger测序验证结果 患儿为突变c.1966C > T和c.310+2Tdup的复合杂合子;父亲为c.310+2Tdup突变携带者;母亲为c.1966C > T突变携带者。

根据临床特点及遗传学分析结果,患儿最终确诊为MYO5B基因突变所致的MVID。

2.2 治疗与结局

患儿以先天性腹泻、电解质紊乱、新生儿高胆红素血症、营养不良收住院。给予无乳糖强化中链脂肪酸奶粉喂养,以及胃肠减压、静脉营养等对症治疗,但疗效欠佳。患儿腹泻顽固,代谢性酸中毒(表 1)和电解质絮乱(表 2)难以纠正,且转氨酶、GGT、TBA、胆红素等胆汁淤积指标持续高于正常范围(表 3)。住院1月余自动出院,出院后失访。

3 讨论

靶向Panel高通量测序作为二代测序技术的一种,能够针对性地检测出来源于同一通路结构的多种基因相关疾病,并对临床表现相同的遗传性疾病进行鉴别诊断;是一种低成本、有效、快速的分子诊断方法[10]。靶向Panel高通量测序与Sanger测序相结合,100%覆盖该Panel所含基因[11]。本研究患儿进行多次多项辅助检查均未找到病因,考虑为遗传性疾病;且仅靠临床特点难以确定致病基因,行二代测序技术分析消化系统疾病相关基因结合Sanger测序验证后,发现患儿为MYO5B基因突变c.310+2Tdup和c.1966C > T(p.R656C)的复合杂合子,其父母分别为以上突变的携带者,最终确诊MVID。

MYO5B基因位于染色体18q21.1,含有40个外显子和39个内含子,基因组全长372 kb,编码由1 848个氨基酸组成的Vb型肌球蛋白[4]。Vb型肌球蛋白可调节肠上皮细胞的膜运输和再循环[2];此外,MYO5B蛋白与Rab8a、Rab11a可形成Rab GTP酶-MYO5B复合物,不仅可以转运微绒毛的关键组成部分,促进微绒毛的生长,而且对顶端三磷酸腺苷结合盒转运蛋白(如BESP和MDR3)的转运功能和维持细胞极化有重要作用[12-16]。MYO5B基因突变所致的MVID中出现的难治性腹泻可能与肠上皮细胞顶端转运蛋白,如Rab8a、Rab11a和顶端转运钠氢交换体3的错位分布,致使肠上皮细胞的极化和刷状缘完整性受损有关[12, 17]。此外。MYO5B蛋白在肺、胃、肠和肾等多个组织的上皮细胞均表达[2];故MVID患者中常有肠外表现,如血尿、肾Fanconi综合征、低血磷性佝偻病、糖尿病、精神异常,以及心脏、肺和肝功能异常等[4]。本例患儿表现为严重而难治性的腹泻、胆汁淤积症、电解质絮乱、代谢性酸中毒,伴尿常规明显异常,符合MVID的临床表现。

2008年,Müller等[12]首次报道MYO5B基因突变与MVID有关。迄今为止,已发现40余种突变类型,包括错义、无义、缺失、插入、剪接位点突变等[3, 4, 7-9, 12, 18-20]。根据突变对Vb型肌球蛋白结构和功能的影响,可将其分为5种类型,包括与肌动蛋白相互作用的错义突变区、核苷酸结合的错义突变区、动力变构重排的错义突变区、蛋白错误折叠的突变区和蛋白质提前终止区[4]。本研究患儿的MYO5B基因突变c.1966C > T(p.R656C)位于动力变构重排的错义突变区,会影响Vb型肌球蛋白的变构运动重排,致使其动力功能受损[4, 12]。此外,经多个软件预测,剪接位点突变c.310+2Tdup可导致前体mRNA剪接异常,影响Vb型肌球蛋白的正常合成。两个突变共同作用,致使本研究患儿出现MVID的一系列临床表现。

大部分MVID患者常表现为以正常或低水平的血清GGT为特点的肝内胆汁淤积症,其发生机制可能与肝细胞的MYO5B/Rab11a顶端回收内体通路受损,毛细胆管膜上BSEP表达改变,以及回肠吸收胆汁酸和肝摄取胆汁酸增多有关[14]。此外,MVID患者因长期腹泻,吸收障碍常需要进行肠外营养,而肠外营养可引起胆汁淤积,表现为血清结合胆红素、碱性磷酸酶、转氨酶和GGT升高[21];故亦有小部分MVID患者中血清GGT呈高水平。本研究患者已进行肠外营养,且多次进行生化检查,发现刚开始GGT水平为轻度增高,后呈上升趋势。GGT水平的这种改变,考虑为上述因素的混合作用所致。而本研究患者肝内胆汁淤积进行性加重,其原因可能为:MVID患者的回肠胆汁酸吸收能力呈不同程度的受损[14];肠内胆汁酸浓度减低和毛细胆管膜分泌胆汁酸减少,可上调顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白,致使胆汁酸的肠重吸收增加,胆汁酸肝细胞毒性随之增加,加速肝脏疾病进展[21]

MVID预后较差,目前尚无有效的药物治疗,常需行肠外营养和肠移植[4]。Ruemmele等[22]提出早期小肠移植结合结肠移植可明显改善MVID患者的预后,提高其生活质量。随后van Hoeve等[23]提出肠移植之前,进行不完全的小肠切除可改善水和电解质絮乱,从而提高生存率。另外,对于MYO5B基因突变造成胆汁淤积者,可给予熊去氧胆酸和部分胆汁分流术治疗,以改善症状[16]。本研究患儿给予无乳糖并强化中链脂肪酸奶粉喂养,以及胃肠减压、静脉营养和熊去氧胆酸治疗,疗效欠佳,且因患儿出院后失访,其远期预后无法随访观察。

综上所述,本研究报道了1例MVID患儿的临床表现和实验室检查特点。通过二代测序技术及Sanger测序验证,发现其为MYO5B基因突变c.310+2Tdup和c.1966C > T的复合杂合子,其中c.310+2Tdup为新的剪接位点突变,从而明确其病因诊断为MVID。本研究扩展了MYO5B基因突变谱,同时为患者分子诊断、临床管理及产前诊断提供了依据。

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