2018, Vol. 20
呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染（lower respiratory tract infection, LRTI）最主要的病原，至今尚无安全有效的疫苗[1]。RSV是非节段性、单股负链RNA病毒，包括10个蛋白编码基因表达11种蛋白，其中G蛋白是最易发生抗原变异的包膜糖蛋白。病毒发生抗原变异后可逃避宿主的免疫攻击，是导致RSV感染暴发和重复感染的重要原因之一[2]，G蛋白基因的变异及进化特征已成为RSV分子流行病学的研究热点。本研究对浙江南部3个地区5个连续流行年度住院儿童进行RSV检测及亚型分型，并对RSV A亚型G蛋白进行基因测序及进化分析，探讨A亚型基因型分布及其G蛋白基因变异特征，为RSV疾病防控及疫苗研制提供参考。
1 资料与方法 1.1 研究对象及标本采集以2009年7月1日至2014年6月30日，浙江省温州、台州及丽水地区3家三级甲等医院因肺炎和毛细支气管炎住院的5岁以下患儿为研究对象。患儿入院48 h内取鼻咽分泌物约1 mL置于2 mL生理盐水中，应用直接免疫荧光法（DIF）筛查RSV抗原。按照简单随机抽样法，每个流行年度（以每年的7月1日到次年6月30日）抽取RSV抗原阳性标本200份以检测RSV亚型。
1.2 主要仪器及设备DIF试剂购自美国Chemicon公司；RNA提取试剂盒购自北京博凌科为生物科技有限公司，逆转录试剂盒均购自于TaKaRa（大连）有限公司；PCR MasterMix购自北京天根科技有限公司；DNAMarker购自上海捷瑞生物有限公司；ABI-PCR仪购自美国ABI公司；电泳仪BIO-RAD power/PAC 3000型购自北京六一仪器厂。
1.3 实验方法（1）病毒总RNA提取及反转录：取标本上清200 μL，采用RNA提取试剂盒提取患儿标本上清中的RSV RNA。反转录采用TaKaRa公司的试剂盒进行。以反转录体系20 μL为例：取RNA 5 μL，按照说明书加入5xPrimeScript®Buffer 4 μL，PrimeScript®RT Enzyme Mix I、Oligo dTPrime各1 μL、Random 6 mers 4 μL，取RNA 4 μL，加入RNase free dH2O补足至20 μL；反应条件为37℃逆转录反应15 min，85℃逆转酶失活5 s；-20℃保存。
（2）RSV亚型鉴定：引物设计及扩增反应参照文献[3]。第一步PCR扩增产物覆盖G蛋白全基因序列，反应体系（40 μL）：cDNA模板2 μL，P1、P2各1 μL，2×PCR Master Mix 20 μL，ddH2O 16 μL；反应条件为：预变性94℃、3 min；94℃、60℃、72℃各1 min扩增35个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。第二步PCR扩增的产物长度为250 bp的A亚型基因片段或长度为341 bp的B亚型基因片段，反应体系（20 μL）：PCR第一步产物1.0 μL，P3、P4、P5各0.5 μL，2×PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7.5 μL；反应条件为：94℃预变性5 min；94℃、50℃各30 s，70℃、40 s，扩增30个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。取第二步PCR产物5 μL，加入制备的2%琼脂糖凝胶加样孔，电泳缓冲液为1×TBE 100 V恒压，电泳30~40 min，阴性对照为ddH2O，阳性对照为标准株A2株（首都儿科研究所馈赠）及CH18537株（购自美国ATCC），电泳结束后将琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统拍照并记录结果。
（3）基因测序：使用SPSS 19.0统计软件自带抽样功能，每个流行年度随机抽取25株A亚型G蛋白基因序列产物（依次编号为WENZHOUA1-WENZHOUA125等），送上海英骏公司完成测序。
（4）系统进化分析：使用DNAstar软件中EditSeq和MegAlign等方法，对A亚型的核苷酸和氨基酸序列与GenBank中已有RSV原型株的序列进行比较和分析，并在MEGA6.06软件上应用N-J法绘制基因进化树进行分析，比较方法采用Clustal W法。
1.4 临床资料收集由专人收集所有RSV阳性患儿的临床资料，包括性别、年龄、发病季节、临床诊断、诊治经过等。
1.5 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析，计数资料以例数和百分率（%）表示，组间比较采用卡方检验。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 RSV亚型的检出情况2009~2014年度共送检25 449份下呼吸道分泌物标本，其中6 416份（25.21%）标本RSV阳性，各年度检出率依次为20.31%（941/4 631）、26.37%（1 184/4 490）、36.79%（1 799/4 890），20.96%（1 071/5 109）和22.45%（1 421/6 329）。
所抽取的1 000份RSV阳性标本经过巢氏PCR扩增共检出A亚型株有462株（46.2%），B亚型株有538株（53.8%）。A亚型依次占2009~2014年各年度的22.5%（45/200）、74.5%（149/200）、84.5%（169/200）、19.0%（38/200）、30.5%（61/200），B亚型依次占各年度的77.5%（155/200）、25.5%（51/200）、15.5%（31/200）、81.0%（162/200）、69.5%（139/200）。结果显示2010~2012年度中，与B亚型相比，A亚型占主导，差异具有统计学意义（P < 0.05）。图 1示2009~2014年5个年度1 000份阳性标本RSV亚型检出数及不同月份RSV亚型检出情况，可见每年的12月到次年的3~4月，RSV检出阳性率最高，其中2010~2012两个年度RSV以A亚型流行为主，其余3个年度均以B亚型流行为主。
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图 1 2009~2014年度RSV亚型检出情况 显示2010~2012两个年度RSV以A亚型流行为主，其余3个年度均以B亚型流行为主。 |
462例A亚型感染患儿中，男307例（66.5%），女155例（33.5%），男女比为1.98 : 1；其中小于6月龄258例（55.8%），6月龄至2岁184例（39.8%），2岁以上至5岁20例（4.3%）。感染发生在每年的12月至次年4月有354例（76.6%）。临床诊断为毛细支气管炎261例（56.5%），支气管肺炎201例（43.5%）。145例（31.4%）有低热，151例（32.7%）出现呼吸费力，12例有肝功能损害，8例合并心功能不全。89例有基础疾病，64例需吸氧，入住重症监护室41例，机械通气14例。
538例B亚型感染患儿中，男360例（66.9%），女178例（33.1%），男女比为2.02 : 1；其中小于6月龄302例（56.1%），6月龄至2岁234例（43.5%），2岁以上至5岁2例（0.4%）。感染发生在每年的12月至次年4月有413例（76.8%）。临床诊断为毛细支气管炎333例（61.9%），支气管肺炎205例（38.1%）。236例（43.9%）有低热，198例（36.8%）出现呼吸费力，15例有肝功能损害，10例合并心功能不全。112例有基础疾病，82例需吸氧，入住重症监护室23例，机械通气6例。
2.3 RSV亚型的基因型分布每个流行年度随机抽取25株A亚型基因共125株进行测序，获得52株A亚型G蛋白基因序列，对第二高变区（HVR2）区域进行基因序列比对及构建系统进化树，结果显示A亚型基因型分布于4个分枝，其中39株基因序列与NA1原型株NG-016-04的同源性达94.1%~99.6%，属于NA1基因型，均于2009~2013年度检出，是这4个流行年度的优势基因型。10株HVR2含有72个重复核苷酸序列插入，与ON1原型株ON138-0111A的同源性达98.2%~100%，属于ON1基因型，其中首株（WENZHOUA68）于2011年12月检出，其余9株均于2013~2014年度检出，并且是该年度A亚型唯一的基因型。2株（WENZHOUA15、WENZHOUA22）与GA2原型株CH28的同源性达99.3%，属GA2基因型，于2009~2010年度检出。WENZHOUA64与原型株BJ/36578的同源性达99.3%，属NA4基因型，于2011~2012年度检出。B亚型中以BA9基因型最多（44/60，73.3%），5个流行年度均有检出，是除2010~2011年度外B亚型的优势基因型，并且是2013~2014年度B亚型唯一基因型，其次为BA8基因型（6/60，10.0%）。本研究将针对A亚型及其各类基因型进行分析与讨论，结果详见表 1、图 2。
| 表 1 2009~2014 5个流行年度A亚型基因型检出分布 |
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图 2 A亚型G蛋白系统进化树 依据RSV A亚型HVR2构建无根进化树，采用neighbor-joining方法，每种基因型的参考序列来自GenBank; Bootstrap 1 000次，计算方法采用Kimura 2-parameter model，标尺表示遗传距离，进化树分枝上仅显示Bootstrap value ≥ 60%的数值。显示A亚型基因型分布于4个分枝，其中39株属于NA1基因型，10株属于ON1基因型，2株属于GA2基因型，1株属于NA4基因型。 |
A亚型G蛋白基因与原型株A2的核苷酸同源性为80.7%~89.3%，氨基酸同源性为74.4%~82.6%；52株A亚型之间的核苷酸及氨基酸同源性分别为81.5%~100%和80.2%~100%。
NA1和ON1基因终止密码子全部为TGA，GA2和NA4基因终止密码子均为TAG。通过氨基酸序列比对发现，N237糖基化存在于NA1和GA2基因型中；N251糖基化存在于除WENZHOUA53、72、79外的其他NA1基因型中；除WENZHOUA42、48外，其他A亚型均存在N294糖基化。ON1基因型插入的23个重复氨基酸与原型株之间也存在差异，WENZHOU112第262位、WENZHOU121第271位均发生E突变为K（E262K、E271K），WENZHOU105第295位发生S突变为N（S295N），但其对应位点286、295、271没有改变。也有对应氨基酸位点同时突变为同一个氨基酸残基的，如WENZHOU117氨基酸第274位点L突变为P，其对应第298位点也发生L突变为P。此外，HVR2其他位点的突变如E232G、T253K存在于所有ON1基因株中。WENZHOUA64替代包括N242I、P274Q、T293S、N251D。RSV A亚型G蛋白氨基酸序列比较见图 3。
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图 3 RSV A亚型G蛋白氨基酸序列比较 显示N237糖基化存在于NA1和GA2基因型中，ON1基因型插入的23个重复氨基酸与原型株之间也存在差异，包括突变、替代。E：谷氨酸；K：赖氨酸；S：丝氨酸；N：天冬酰胺；L：亮氨酸；P：脯氨酸；G：甘氨酸；T：苏氨酸；I：异亮氨酸；Q：谷氨酰胺；D:天冬氨酸。 |
RSV感染可全年散发但以冬春季为主，流行常在每年的11月或12月开始，1月或2月达高峰，持续4~5个月[4-5]。本研究结果显示浙江南部地区儿童RSV感染流行季节为每年的12月到次年的3~4月，与Yoshihara等[6]报道一致。2009~2014各流行年度均可检出A亚型，其中A亚型是2010~2012两个流行年度的优势亚型，与北京、上海、重庆的报道一致[7-9]。然而深圳市2012~2013流行年度中以B亚型为主[10]，武汉市2014~2015流行年度中以A亚型检出为多[11]，北京地区2006~2016流行年度中，大部分流行年度以一个亚型为主，但也有两个流行年度为A、B亚型共同主导[12]。显示不同流行年度我国不同地区不同气候下RSV优势亚型存在差异，因此有必要连续监测本地区RSV亚型流行趋势，为预防和控制RSV感染提供指导，为筛选疫苗株提供参考。
本研究在2009~2014连续5个流行年度共检出4种A亚型基因型（NA1、NA4、ON1、GA2），其中前4个流行年度的优势基因型为NA1，最后一个流行年度仅检出ON1基因型，表明存在不同RSV A亚型基因型的共循环。NA1基因型曾经是多个地区A亚型的优势基因型[6-7, 10, 12-13]。然而自2010年加拿大首次检出ON1基因型后[14]，ON1基因型已成为部分国家A亚型的优势基因型[11, 15-16]。韩国学者研究发现，2010~2013连续3个流行年度中ON1基因型依次占A亚型的0.0%、17.4%、94.6%，表明ON1基因型存在快速传播趋势[16]。ON1基因型也是意大利2010~2013流行年度A亚型的优势基因型，其快速传播可能由G蛋白变异所致[17]。ON1基因型在避免当前宿主免疫方面具有优势[18]。研究ON1基因型的传播对于了解RSV遗传变异对其流行病学特征的影响非常重要[11]。国内多地也于2011~2012年度检出少量ON1基因型[7-9]，Cui等[18]报道ON1已快速取代其他基因型成为2012~2014年度北京地区的优势基因型。本研究于2011年12月在浙江南部地区首次检出1株ON1型RSV菌株，2013~2014年度检出数增至9株，并且是A亚型菌株唯一的基因型，表明ON1已成为本地区该流行年度的优势基因型，有必要进一步监测未来ON1基因型的流行趋势。
各地检出的RSV亚型株之间核苷酸及氨基酸的同源性有明显差异，其中北京分离株之间核苷酸的同源性在87.8%~100%之间, 氨基酸同源性在77.9%~100%之间[19]，重庆A亚型分离株之间核苷酸序列和氨基酸序列的差异分别为13%~14.8%和20.5%~26.1%[18]。本研究显示2009~2014浙江南部地区RSV A亚型分离株之间核苷酸及氨基酸的同源性分别为80.7%~89.3%和74.4%~82.6%，分离株之间的遗传变异较大，表明2009~2014年度有多个不同的RSV A亚型基因型毒株在浙江南部地区共循环。
RSV A亚型G蛋白核苷酸的变异并同时存在氨基酸变异。NA4基因型的变异特点是N242I、P274Q和T293S的替代突变，WENZHOUA64属于NA4基因型，与原型株BJ/36578的同源性达99.3%，显示两者有非常近的亲缘关系[7]，这些变异可使其逃避宿主的免疫攻击，导致反复感染[20]。ON1基因型的变异特点则是G蛋白C末端23个重复氨基酸序列的插入，经过与ON1原型株（ON67-1210A、JN257693）及GenBank中的代表株比对，本研究中ON1基因型插入的重复氨基酸也存在替代突变，如WENZHOU67（L274P、L298P），WENZHOU62（E262K）和WENZHOU71（E271K）的突变，但其对应位点286、295却没有发生突变。ON1基因型的替代突变与欧洲学者的报道相似[16-17]。ON1基因型插入片段已经发生了核苷酸的替换，这些变异可能帮助病毒逃逸，可能是ON1基因型取代其他基因型成为优势基因型的原因，这一特征对提供人群免疫力的疫苗具有潜在影响，在确定疾病严重程度中的作用需要进一步研究[20]。另外，Kim等[17]报道了8株ON1基因型的框移突变，即G蛋白HVR2缺失1个核苷酸，从而导致比其他的ON1基因型多两个氨基酸残基，但本研究未发现上述突变。G蛋白HVR2的变异是RSV逃避宿主免疫的基础，也可能是亚型内新基因型流行的原因[7]。NA1基因型的变异特点是N糖基化位点突变，N237、N250糖基化位点消失[21]，但本研究检出10株存在N237糖基化位点的NA1基因型，与北京地区报道一致[7]。有学者认为G蛋白N-糖基化位点的变异最终使病毒的抗原性改变，是病毒进化的优势[16]，基于N-糖基化位点的阳性选择可能在驱动病毒多样性中发挥重要作用[22]。
本研究针对浙江南部地区不同城市RSV分子流行病学研究，地域较为局限，且由于课题经费有限，外送基因型检测的样本量偏小，因此有必要进一步监测和测序RSV病毒株，以确定这些优势基因型是否仍在本地区流行，是否这些优势基因型会持续主导或随时间推移而逐年波动。
综上所述，RSV A亚型为浙江南部地区2010~2012流行年度的主导亚型，存在多种优势基因型共循环。ON1基因型已成为2013~2014流行年度的优势基因型。A亚型变异显著，包括替代、插入和重复突变。
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