2018, Vol. 20
学龄期是儿童生理、心理发展最迅速的阶段之一，儿童从幼儿园步入小学，以游戏活动为主转变为以学习活动为主，认知水平和社会性进一步发展[1]。气质是儿童心理活动的稳定动力特征，在儿童社会性和个性发展过程中具有重要地位和作用，对其未来的学习和社会适应能力等方面具有重要影响[2-3]。气质受遗传和环境的双重影响，近年来，我国学者对不同时期双生子儿童气质维度的遗传度分析发现，学龄儿童各气质维度的遗传度变异较大（21.7%~90.4%），并呈现一定的性别和年龄差异[4-5]。
多巴胺能系统参与大脑应答，其中多巴胺D4受体（D4 dopamine receptor, DRD4）主要分布于大脑边缘区，与情感、行为和认知存在密切的联系[6]。DRD4结构和功能受DRD4基因的影响，在人格和气质相关研究中，DRD4基因作为重要的候选基因之一近年来受到广泛关注。DRD4基因定位于11p15.5，目前已发现DRD4基因多态性20多种，DRD4基因第3外显子48bp可变串联重复序列（variable number of tandem repeats, VNTR）是最常见的多态性，编码16个氨基酸，可出现2~11次重复（2R~11R）[7-8]。国外有研究发现，携带DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR长片段的婴幼儿反应强度低[9]、情绪积极[10]，携带DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR长片段的儿童及青少年社交性低、情绪性低[11]，而Kim等[12]对成人研究发现，DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR与各气质维度无相关性。国内关宏岩等[13]通过对儿童气质进行追踪研究发现，DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR可能与婴儿期儿童的反应强度有关。
目前，国内外关于气质与DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR的相关性报道多涉及婴幼儿、成人[9-13]。本研究以学龄儿童为研究对象，结合DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR进行关联分析，从DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR和环境因素的交互作用角度探究气质特点，有利于了解环境与DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR对学龄期儿童气质的影响。
1 资料与方法 1.1 研究对象在学校、父母、儿童知情同意下，随机整群抽取内蒙古呼和浩特市某小学350名8~12岁学生进行问卷调查，其中一半儿童进行口腔上皮采集。被试儿童均身心健康，无心理疾病和外在行为明显的异常，家中无精神疾病患者。剔除资料不完整者及汉族以外的其他民族样本，共回收有效问卷326份（回收率93.1%）。其中男153例，平均年龄9.8±1.3岁；女173例，平均年龄9.8±1.4岁。对326份样本中，164例口腔上皮细胞中DNA浓度较高且各组资料完整的样本进行分子生物学实验，其中男66例，平均年龄9.7±1.3岁；女97例，平均年龄9.7±1.5岁。
1.2 方法（1）儿童气质测评：采用Carey等编制并经标准化的8~12岁儿童气质问卷（Middle Childhood Temperament Questionnaire）对儿童气质进行测评。该问卷由家长填写。活动水平、反应强度、注意分散度为正向计分，得分越高则对应维度的程度越高；可预见性/组织性、趋避性、适应性、情绪性、坚持性、反应阈为反向计分，得分越高则对应维度的程度越低[14]。
（2）儿童基本情况及家庭基本环境调查：由儿童的家长填写问卷，主要内容包括儿童性别、年龄，以及儿童父母生育年龄、职业、文化程度等。
（3）父母教养方式测评及家庭功能测评：使用Perris等1980年编制、岳冬梅修订的父母教养方式量表（EMBU）对家庭教养方式进行粗分[14-15]；使用Olson等1982年编制、费立鹏第3次修改的中文版家庭亲密度及适应性量表（FACES Ⅱ-CV，第3次修订）计算家庭亲密度及适应性得分[14, 16]。
（4）口腔上皮细胞的采集：指导儿童漱口，除去口中异物，使用灭菌的一次性匙羹塑料吸管的勺状端刮取口腔上皮细胞，置于盛有无水乙醇的离心管中保存。
（5）基因组DNA提取及基因型判定：采用TIANamp Swab DNA Kit（TIANGEN BIOTECH, Beijing）试剂盒提取全基因组DNA进行基因型测定。上游引物为5' -GCCCGCTCATGCTGCTGCTCTA-3' ；下游引物为5' -ATCTTGGCACGCCGCCTCCT-3' 。聚合酶链式反应（PCR）体系：25 ng模板DNA 1 μL，Mix 13 μL（200 μmol/L dNTPs、2×Taq Buffer、1.5 mmol/L MgCl2、1 U Taq DNA聚合酶），15 ng上、下游引物各1 μL，ddH2O 9 μL。PCR循环条件：95℃预变性5 min，35个循环（94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸5 min，4℃保存。PCR产物与分型标准物用2%的琼脂糖凝胶电泳，恒定电压为100 V，时间为40 min，经天能凝胶电泳成像系统处理后进行基因型判读。依据片段大小判断等位基因重复次数，共发现4种等位基因：DRD4*2（14.7%）、DRD4*4（79.3%）、DRD4*6（5.5%）、DRD4*7（0.6%）（DRD4*2代表 2次重复，DRD4*4代表 4次重复，依次类推）。本研究样本中，各基因型及其频率为：DRD4*4/DRD4*2（29.3%）、DRD4*4/DRD4*4（58.5%）、DRD4*4/DRD4*6（11.0%）、DRD4*4/DRD4*7（1.2%）。
1.3 统计学分析使用SPSS 16.0软件对数据进行处理与分析。连续变量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间的比较采用成组t检验；非连续变量用例数（n）和百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。气质维度属于连续变量，分析气质维度得分与其他因素的相关性采用多元线性回归分析；为分析气质维度得分高低受基因及其他因素的影响，将气质维度转化为二分变量，并采用非条件logistic回归分析。logistic回归分析时，参照8~12岁儿童气质全国常模[17]对气质维度得分标准化，以0为界限将被试划分为“高”“低”两组，得分 > 0为高分组，得分 < 0为低分组；按照费立鹏给出的拱级模式[16]将家庭亲密度以63.9为界划分“高”“低”两组。P < 0.05示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 Hardy-Weinberg平衡的吻合度检验对DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验。结果显示，该基因型期望值与观测值吻合很好（χ2=11.218，P > 0.05），符合Hardy-Weinberg平衡定律。
2.2 DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR在学龄儿童不同气质类型的分布由于DRD4长重复序列在亚洲人群的基因频率明显低于欧洲及美洲人群[13]，故本研究根据国内常规分法，将DRD4基因型中含有2次重复序列记为短重复序列，用S-DRD4表示；含有4、6、7次重复记为长重复序列，用L-DRD4表示。根据可预见性/组织性、趋避性、适应性、反应强度、情绪本质5个维度得分将儿童气质划分为5种气质类型（难养型、易养型、启动缓慢型、中间偏难养型、中间偏易养型）；根据其气质性质，分为积极/消极两种气质类型[14]。运用χ2检验分析DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR对气质类型的影响，结果见表 1：DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR在难养型等5种不同气质类型的分布差异无统计学意义；在积极/消极两种气质类型的分布差异无统计学意义。
| 表 1 DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR在不同气质类型中的分布 |
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携带L-DRD4基因型儿童在活动水平、反应强度、情绪本质以及坚持性4个维度的得分均低于S-DRD4基因型儿童（P < 0.05），见表 2。
| 表 2 DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR与气质维度得分 |
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对儿童气质维度与儿童性别、年龄、父母教养方式、家庭亲密度与适应性等环境因素进行多元线性回归分析，发现性别、年龄、父亲惩罚严厉、家庭亲密度、母亲教养方式为拒绝/否认是影响儿童气质的主要因素，差异有统计学意义（P < 0.05）。以上述各变量、DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR以及该基因与各变量的交互作用为预测变量，以活动水平、反应强度、情绪本质以及坚持性得分标准化分组后为因变量，运用Backward LR法进行logistic回归分析。模型中因变量及预测变量均以标准化分组并用0、1表示（低亲密度=0，母亲非拒绝/否认=0，高亲密度=1，母亲拒绝/否认=1）。结果显示（表 3），母亲教养方式为拒绝/否认及性别作为主效应对儿童活动水平影响显著，母亲教养方式为拒绝/否认者的活动水平是非拒绝/否认者的2.3倍（OR=2.281，P < 0.05），男童活动水平是女童的2.8倍（OR=2.766，P < 0.05）。DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR与儿童性别的交互作用对儿童活动水平有影响（OR=0.582，P < 0.05）。结合交互作用图（图 1）可发现，携带L-DRD4基因型男童的活动水平大于女童，但携带S-DRD4基因型女童的活动水平大于男童，说明携带S-DRD4基因型儿童可增强女童的活动水平。DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR作为主效应对儿童反应强度影响显著，携带L-DRD4基因型儿童反应强度倾向于较弱（OR=0.314，P < 0.01）。DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR与母亲教养方式为拒绝/否认的交互作用对儿童反应强度有影响（OR=1.872，P < 0.01）。结合交互作用图（图 2）可发现，母亲教养方式为拒绝/否认儿童的反应强度大于母亲非拒绝/否认儿童，且携带L-DRD4基因型儿童其母亲教养方式为拒绝/否认者的反应强度明显大于母亲非拒绝/否认者，说明母亲采取拒绝/否认的教养方式可增加儿童的反应强度，且对携带L-DRD4儿童的作用更加明显。DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR、母亲教养方式为拒绝/否认作为主效应对坚持性影响显著，携带L-DRD4基因型儿童坚持性较强（OR=0.420，P < 0.05），母亲拒绝/否认的教养方式是儿童坚持性倾向于较差的风险因素（OR=2.236，P < 0.05）。
| 表 3 DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR与性别、年龄及环境因素交互作用对学龄儿童气质维度的影响 |
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图 1 DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR与儿童性别的交互作用对儿童活动水平的影响 活动水平标准化值为参照8~12岁儿童气质全国常模[17]进行标准化的值。L-DRD4基因型表示长重复序列，S-DRD4基因型表示短重复序列。 |
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图 2 DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR与儿童性别的交互作用对儿童活动水平的影响 反应强度标准化值为参照8~12岁儿童气质全国常模[17]进行标准化的值。L-DRD4基因型表示长重复序列，S-DRD4基因型表示短重复序列。 |
有研究发现，在国内外DRD4等位基因4次重复（64.3%）最为常见，其次是2次重复（8.2%）和7次重复（20.6%）[18]，而亚洲人群以4次重复最多、其次为2次重复，7次重复较少[19]。本研究发现，4次重复占79.3%，7次重复占0.6%，符合亚洲人群的分布[19]。
本研究采用Carey儿童气质问卷对儿童气质进行测评，发现DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR与儿童的活动水平、反应强度、情绪本质、坚持性4个气质维度可能存在相关。携带L-DRD4基因型儿童活动水平、反应强度、情绪本质及坚持性得分均低于携带S-DRD4基因型儿童，表明DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR长重复序列的儿童相对短重复序列的儿童表现出活动水平较低、情绪积极、对负性刺激反应较弱、坚持性强的特点。本研究与既往某些研究结果较为接近，如Pappa等[11]在青少年及儿童DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR与行为气质的一项定量评估中发现，携带DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR长重复序列（6次重复以上）的儿童与社交性、情绪性相关；郭贞美等[20]报道DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR长重复序列组（3、5、9次等位基因至少含有一个）儿童气质维度中的注意力分散度更低，更难被外界干扰。但本研究与既往某些研究结果相悖，如De Luca等[21]在婴幼儿的相关研究中发现，携带DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR长重复序列（7次重复）的儿童更易出现高反应强度的气质特点（如脾气暴躁等）；关宏岩等[13]报道携带DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR长重复序列（4次重复以上）的婴儿反应强度得分较高，表现出易激惹的特点。各研究结果不一致，可能与研究的人群、年龄及使用气质量表不同等因素有关。
本研究发现母亲教养方式为拒绝/否认对儿童活动水平有影响，与王冠予等[22]对幼儿活动水平与家庭教养方式的研究结果相似。有研究表明良好的养育方式可促进父母与孩子间的互相理解[23]。母亲教养方式为拒绝/否认的儿童活动水平高于非拒绝/否认，但未发现母亲教养方式为拒绝/否认与DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR的交互作用对儿童活动水平有影响。本研究发现儿童的活动水平与性别有关，男童的活动水平高于女童，与以往研究结果一致[24]。DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR与儿童性别的交互作用可能对儿童活动水平有影响，携带S-DRD4基因型可能增加女童活动水平，提示儿童活动水平不仅与性别、后天环境有关，与基因的关系也密不可分。
本研究发现DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR的主效应对儿童反应强度影响显著，携带S-DRD4基因型儿童反应强度高，说明携带S-DRD4基因型是反应强度的风险因素。DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR与母亲教养方式为拒绝/否认的交互作用可能对儿童反应强度有影响，当母亲教养孩子出现过多的拒绝/否认时，儿童的反应强度增加，且携带L-DRD4基因型儿童的作用更加明显。母亲较多拒绝/否认，儿童会缺乏成就感、安全性，会造成儿童对母亲的疏远，反应强度会更加剧烈。有研究表明，母亲过度拒绝/否认对儿童成长不利，儿童出现不自信、没有安全感、恐惧等现象，会导致注意力缺陷多动障碍、双相情感障碍等疾病的发生[25]。此外，本研究发现，DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR及母亲拒绝/否认作为主效应对坚持性影响显著，携带L-DRD4基因型儿童坚持性较强。母亲拒绝/否认的教养方式是儿童坚持性倾向于较差的风险因素，故提示母亲能够及时理解孩子的想法，较多地接受和认可，是促进儿童形成稳重性格的有利条件。
综上，本研究以内蒙古呼和浩特市汉族学龄儿童为研究对象，探讨了DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR与学龄儿童气质的相关性，发现DRD4 exon Ⅲ 48bp VNTR与学龄儿童的活动水平、反应强度、情绪本质、坚持性4个气质维度存在相关。但由于研究样本量相对较少，目前结果只能作为初步探讨。此外，本研究样本为汉族儿童，但是样本来自于内蒙古地区，虽然剔除了其他民族个体，但民族混杂因素仍难以完全避免，这也是本研究的不足之处。因此，今后需扩大样本量，对蒙古族与汉族进行比较，深入分析该基因与环境的交互作用对儿童气质特征的影响，并进一步探讨与气质可能相关的其他候选基因对气质的影响，更全面地探讨基因与环境、基因与基因的交互作用对气质的影响。
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