肠源性感染与肠黏膜机械屏障破坏相关，紧密连接蛋白ZO-1等是肠道屏障的重要组分，紧密连接能够阻止毒性大分子及微生物入侵。炎症因子包括脂多糖（LPS）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1（IL-1）等可损害肠道屏障。Toll样受体是广泛表达于哺乳动物细胞表面的一种跨膜信号转导蛋白，是LPS的主要受体，是LPS-TLR介导的信号转导通路中的关键环节^[1]。LPS-TLR4通路是目前较为明确的炎症通路，是目前医学领域研究的热点^[2]。LPS主要通过LPS-TLR通路发挥毒性作用，LPS与TLR结合后激活核转录因子NF-κB，从而诱导炎症因子TNF-α的产生，损伤肠道屏障。本实验通过检测NF-κBp65、TNF-α及ZO-1的mRNA和蛋白表达情况，验证Toll样受体阻断剂（TLR4-Ab、TLR2-Ab）是否对LPS引起的紧密连接损伤具有拮抗作用，以期为肠源性感染的治疗提供理论依据。

TLR4单克隆抗体（TLR4mAb，CD282.121802）和TLR2单克隆抗体（TLR2mAb，CD284.117602）购自美国eBiosime公司。内毒素（O55:B5）和LPS购自美国Sigma公司。TNF-α、NF-κBp65、ZO-1一抗（稀释比1 : 100）购自武汉博士德生物工程有限公司。总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司；PCR引物由北京华大基因公司合成；荧光定量PCR试剂盒购自美国Promega公司。即用型SABC试剂盒及DAB染色剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。小型台式离心机（1-13，美国Sigma公司），高速冷冻离心机（31k5C型，美国Sigma公司），PCR扩增仪（德国Biometra公司），紫外分光光度计（UV300，英国Biochrom公司）。OLYMPUS-BX41图像采集系统及Meta Morph/DP10/BX41软件分析系统（日本Olympus公司）。

清洁级成年BALB/C小鼠32只，雌雄不限，体重为15~25 g，由中国医科大学医学动物实验中心提供。将32只小鼠随机分成对照组、模型组、TLR4处理组及TLR2处理组（n=8）。模型组给予LPS（5 mg/kg）腹腔注射，建立内毒素血症模型^[3]，TLR4处理组给予LPS（5 mg/kg）+TLR4抗体（10 μg/只）腹腔注射，TLR2处理组给予LPS（5 mg/kg）+TLR2抗体（10 μg/只）腹腔注射，对照组以等量生理盐水替代注射。各组分别于注射后3 h处死小鼠，取远端小肠用于免疫组化及RT-PCR检测紧密连接蛋白ZO-1、NF-κBp65及TNF-α的表达情况。

每组取6只小鼠小肠组织，参照TRIzol说明书采取一步法提取总RNA，测定RNA浓度和纯度，逆转录合成cDNA作为模版进行扩增。ZO-1正义序列5'-AGCGAACAGAAGGAGCG-3'；反义序列5'-CTGCCAAACTATCTTGTGAAA-3'，片段长度215 bp。TNF-α正义序列5'-CGGGCAGGTCTACTTT-3'；反义序列5'-TCACTGTCCCAGCATCT-3'，片段长度226 bp。NF-κB正义序列5'-CTCTTTATCTCGCTTTCGG-3'；反义序列5'-TGGCTCCAGTCTGTCCC-3'，片段长度174 bp。β-actin正义序列5'-CTGTCCCTGTATGCC-TCTG-3'；反义序列5'-TGTCACGCACGATTTCC-3'，片段长度217 bp。PCR扩增体系（20 μL）：cDNA 5 μL（1 μg），5×buffer 4 μL，MgCl2 2 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，引物2 μL（100 ng），TagDNA多聚酶1 μL（1 U），ddH₂O补足剩余体积。反应条件：70℃预变性5 min；94℃变性40 s，25℃退火5 min，42℃延伸60 s，共35个循环。取PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳，利用计算机凝胶成像分析系统处理软件量化PCR扩增产物，mRNA相对表达量=目的基因光密度值/β-actin光密度值。

每组取8只小鼠小肠组织，在40 g/L甲醛溶液中固定、包埋、石蜡切片，厚度5 μm。每个时间点选取染色清晰的切片5~8张，于光镜下（×40）随机选取5~6个视野。石蜡切片脱蜡至水，放入30%H₂O₂与蒸馏水的混合液中，室温孵育10 min，灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗；经热修复抗原，滴加5%BSA封闭，室温孵育30 min；滴加抗体（一抗），4℃孵育过夜；冲洗后滴加生物素标记的山羊抗小鼠IgG（二抗），37℃孵育30 min；经冲洗，再滴加SABC液，37℃孵育30 min，冲洗，混匀后DAB显色，室温条件下显色5 min，蒸馏水充分洗涤；苏木素轻度复染10 min，水洗反蓝30 min；脱水，二甲苯透明处理，封片，显微镜下观察。阴性对照：除用PBS代替一抗外，其他步骤同上。以细胞膜有棕黄色染色为ZO-1阳性细胞，以细胞核和细胞质内有均匀的棕黄色颗粒染色为TNF-α和NF-κBp65阳性细胞。免疫组织化学图片测定：利用OLYMPUS摄像系统和Meta-Mroph/BX41图像数据分析系统测定平均积分光密度值（IOD）。

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法，P < 0.05为差异有统计学意义。

模型组ZO-1 mRNA表达明显低于对照组（P < 0.05）；TNF-α、NF-κBp65 mRNA表达均高于对照组（P < 0.05）。TLR4处理组及TLR2处理组中ZO-1 mRNA表达高于模型组，但仍低于对照组（P < 0.05）；TNF-α、NF-κBp65 mRNA表达低于模型组（P < 0.05），且与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。TLR4处理组与TLR2处理组ZO-1、TNF-α及NF-κBp65 mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 1，图 1。

表 1 Table 1

表 1 各组ZO-1、TNF-α及NF-κBp65 mRNA表达水平比较  （x±s）

表 1 各组ZO-1、TNF-α及NF-κBp65 mRNA表达水平比较  （x±s） 组别 n ZO-1 TNF-α NF-κBp65 对照组 6 13.21±2.01 0.32±0.11 1.0±0.8 模型组 6 0.47±0.27a 0.52±0.12a 6.1±2.6a TLR4处理组 6 1.80±0.62a,b 0.36±0.13b 3.4±1.6b TLR2处理组 6 2.48±0.40a,b 0.29±0.13b 2.7±0.9b     F值 178.07 4.18 10.12     P值 < 0.01 0.02 < 0.01 注：a示与对照组相比，P < 0.05；b示与模型组相比，P < 0.05。

图 1 各组ZO-1、TNF-α及NF-κBp65 mRNA表达水平比较（n=6） a示与对照组相比，P < 0.05；b示与模型组相比，P < 0.05。

免疫组化结果显示：对照组ZO-1均匀一致的分布于小肠上皮细胞连接处的顶端，呈蜂巢状；NF-κBp65、TNF-α蛋白表达在小肠绒毛上皮顶端细胞浆和细胞核内。模型组ZO-1分布不均，染色较对照组变浅，ZO-1阳性信号的IOD值较对照组明显降低（P < 0.05）；NF-κBp65、TNF-α染色较对照组变深，蛋白阳性信号的IOD值较对照组明显升高（P < 0.05）。TLR4处理组及TLR2处理组ZO-1染色较模型组深，蛋白阳性信号的IOD值较模型组明显升高（P < 0.05），且与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；NF-κBp65、TNF-α染色较模型组浅，蛋白阳性信号的IOD值较模型组明显降低（P < 0.05），且与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。TLR4处理组与TLR2处理组ZO-1、TNF-α及NF-κBp65蛋白阳性信号IOD值比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 2，图 2~3。

表 2 Table 2

表 2 各组ZO-1、TNF-α及NF-κBp65阳性信号IOD值比较  （x±s）

表 2 各组ZO-1、TNF-α及NF-κBp65阳性信号IOD值比较  （x±s） 组别 n ZO-1 TNF-α NF-κBp65 对照组 8 1 335±106 1 136±234 396±53 模型组 8 170±18a 2 699±213a 777±106a TLR4处理组 8 672±47b 789±169b 159±83b TLR2处理组 8 449±36b 1 960±267b 533±145b F值 293.04 98.36 33.08 P值 < 0.01 < 0.01 < 0.01 注：a示与对照组相比，P < 0.05；b示与模型组相比，P < 0.05。

图 2 各组ZO-1、TNF-α及NF-κBp65阳性信号IOD值比较（n=8） a示与对照组相比，P < 0.05；b示与模型组相比，P < 0.05。

图 3 免疫组化检测各组肠黏膜上皮细胞蛋白定位表达（DAB显色，×40） 对照组ZO-1均匀一致地分布于小肠黏膜上皮细胞连接处的顶端，蛋白阳性表达呈深棕色；TNF-α、NF-κBp65蛋白表达在对照组肠绒毛上皮顶端细胞浆和细胞核内，TNF-α蛋白阳性表达呈浅棕色，NF-κBp65蛋白阳性表达呈棕黄色。模型组ZO-1的分布不均，染色变浅，提示水平较对照组降低；TNF-α及NF-κBp65染色加深，提示水平较对照组升高。TLR4处理组、TLR2处理组ZO-1的分布较均匀，染色加深，提示水平较模型组升高，TNF-α及NF-κBp65染色变浅，提示水平较模型组降低。

机械屏障的基础是细胞间连接, 紧密连接破坏最重要的标志是紧密连接蛋白的减少。ZO-1是一个220 kD的外周膜蛋白，它属于闭锁小带蛋白家族，位于细胞质内膜表面，与绝大多数紧密连接蛋白及细胞骨架相连，是紧密连接的结构性蛋白^[4-7]。LPS进入机体与LPS结合蛋白（LPB）结合形成复合物，再与CD14分子形成LPS-LPB-CD14复合物，将信号传到细胞内，然后激活TLR4，TLR4进一步将LPS信号向下传导，激活NF-κB和MAPK通路^[8]，被激活的NF-κB与特定的DNA区域结合，诱导炎症因子如TNF-α的表达。LPS-TLR信号通路是识别LPS，启动细胞反应的重要途径。TLR信号在肠道上皮细胞损伤后的修复和重建中起重要作用^[9-20]。

有研究显示，用IFN-γ、TNF-α和IL-1β组成的复合因子与Caco-2共同培养后，发现肠屏障功能降低，ZO-1的mRNA表达减少，同时ZO-1、ZO-3和occludin蛋白的表达也降低。TNF-α已被证实是多种疾病引起肠黏膜屏障损伤的重要起动因子，体外实验研究表明TNF-α能增强肠上皮细胞屏障的通透性，这与其影响紧密连接蛋白occludin、ZO-1的表达及分布有一定关系^{[19, 21-26]}。

有文章指出TLR2激动剂提高紧密连接的功能，增加皮肤紧密连接蛋白的表达，包括claudin1、claudin23、occludin、ZO-1，文章中证明TLR2激动剂作用于原代角质形成细胞24 h后观察到紧密连接蛋白的mRNA及蛋白表达比对照组增加^[27]，还有文章证明在体外培养的表皮角质形成细胞，激活TLR2受体，在第一个3 h的细胞紧密连接功能增强^[10]；有研究指出，在体外实验，TLR2通过非典型蛋白激酶C调节人支气管上皮细胞膜的屏障功能，激活TLR2受体并增加claudin-1、ZO-1的表达^[28]；本文研究结果与以上文章的研究结果有差异，不同的是，以上的研究都是体外实验，通过培养人表皮角质形成细胞、人支气管上皮细胞，用TLR2激动剂作用于细胞，来观察对紧密连接蛋白的影响；本研究为动物实验，首先用LPS造成内毒素血症模型，然后分别给予TLR4、TLR2受体阻断剂，选取小肠上皮细胞来观察Toll样受体阻断剂对紧密连接蛋白的影响，是通过LPS来激活Toll样受体，而不是Toll样受体激动剂，LPS-TLR传导通路激活后，最终会产生炎症因子，损伤紧密连接，因此结果与以往研究有差异。分别给予TLR4、TLR2受体阻断剂是为了观察Toll样受体阻断剂是否能减小LPS对紧密连接的损伤作用。

本研究结果显示，在内毒素血症模型小鼠的肠上皮中，LPS被Toll样受体识别后，将信号向下传导，激活NF-κB通路，诱导NF-κB的表达增加，从而分泌大量炎症因子TNF-α，导致ZO-1表达减少和异常分布，损伤小鼠肠上皮紧密连接，造成肠上皮细胞通透性增高，毒素入血，引起内毒素血症。在TLR4单克隆抗体的作用下，与模型组相比，小肠组织紧密连接蛋白ZO-1的mRNA及蛋白表达水平明显增加，TNF-α、NF-κBp65的mRNA及蛋白表达水平明显降低；在TLR2单克隆抗体的作用下，与模型组相比，小肠组织紧密连接蛋白ZO-1的mRNA及蛋白表达水平增加，TNF-α、NF-κBp65的mRNA及蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义。由本实验研究推测，当LPS作用于肠道屏障时，一方面，TLR4、TLR2单克隆抗体分别与小鼠肠道上皮细胞的TLR4、TLR2受体结合，对LPS起到竞争性抑制作用，减少LPS与TLR4、TLR2受体结合，阻碍LPS-TLR信号通路的信号传导，从而对LPS引起的肠道损伤起到抑制作用；另一方面，TLR2、TLR4单克隆抗体通过对LPS-TLR信号通路的调节，上调ZO-1 mRNA，下调NF-κB及炎症因子TNF-α mRNA的表达，从而对ZO-1起到正性调节作用，抑制TNF-α的分泌，对肠道起保护作用。