2018, Vol. 20
2. 四川大学华西医院病理科, 四川 成都 610041
朗格汉斯细胞组织细胞增生症（Langerhans cell histiocytosis, LCH）是病理性朗格汉斯细胞（Langerhans cell, LC）异常克隆增生的一类疾病，好发于儿童，发病率约2~5/百万[1]。LCH临床症状复杂多样，轻者表现为皮肤、单个或多个骨损害伴或不伴尿崩症，重者可累及多个危险器官（如肝、脾、肺及造血系统）。LCH发病机制目前仍不清楚，是炎症性病变还是肿瘤性病变尚有争议[2]。2010年Badalian-Very等[3]研究显示50%以上的LCH存在BRAF-V600E基因突变，高度提示LCH为克隆性肿瘤性疾病。
BRAF基因第15号外显子1 799位碱基点突变（T置换为A）使编码的缬氨酸被谷氨酸替代（即V600E），为最常见的BRAF基因突变类型，见于80%~90%的LCH病例，该突变导致BRAF信号路径持续活化，使下游MEK蛋白激酶和细胞外信号调节激酶ERK（又称为MAPK）磷酸化活化，进而促进肿瘤发生发展[4]。尽管大量研究显示LCH存在BRAF-V600E高频突变，但该突变与LCH发病机制、临床表现及预后等方面的关系仍未完全明确。本研究采用实时荧光定量PCR方法检测26例儿童LCH原发病灶中BRAF-V600E基因突变情况，回顾性分析BRAF-V600E基因突变与LCH患儿临床特征、化疗反应及预后的相关性，探讨BRAF-V600E基因突变在儿童LCH危险度分层和预后评估方面的临床应用价值。
1 资料与方法 1.1 研究对象以2013年11月至2017年7月四川大学华西第二医院收治的经病理确诊且进行了BRAF-V600E基因突变检测的26例初诊LCH患儿为研究对象。其中男性14例、女性12例，男女之比为1.17 : 1。中位发病年龄为27.5个月（4~169个月），其中＜1岁4例，1~5岁14例，＞5岁的8例。所有病例的组织病理标本送检四川大学华西医院病理科，进行组织病理学检查和相关免疫组织化学染色检查（包括Langerin、CD1a及S-100等）。
本研究通过四川大学华西第二医院的医学伦理委员会批准。
1.2 BRAF-V600E基因突变检测使用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒（QIAGEN公司产品，Cat NO.56404）提取病理组织的DNA。采用AmoyDx-BRAF基因突变试剂盒（SFDA）进行实时荧光定量PCR扩增检测BRAF-V600E基因突变，每次PCR反应中加入阳性质控品和阴性对照共同进行分析。
如样本突变信号（FAM信号）呈典型S型扩增曲线且Ct值＜28，判断该样本BRAF-V600E基因突变阳性；如样本FAM信号无典型S型扩增或Ct值≥28，判断BRAF-V600E基因突变阴性；如样本FAM信号呈不典型S型扩增且Ct值接近28，判断BRAF-V600E基因突变可疑阳性。
1.3 LCH的诊断、临床分类及临床分组根据2009年国际组织细胞协会制定的《朗格汉斯细胞组织细胞增生症评估与治疗指南》[5]进行诊断、临床分类及临床分组。所有患儿均符合LCH病理学确诊标准，即在光镜检查基础上，以下3项≥1项阳性：①Langerin（CD207）阳性；②CD1a抗原（T6）阳性；③电镜检查发现病变细胞中存在典型Birbeck颗粒。按照累及器官系统的数目对LCH进行临床分类，包括单系统LCH（SS-LCH）：仅累及一个器官系统（包括单病灶和多病灶），以及多系统LCH（MS-LCH）：≥两个器官系统受累，伴或不伴“危险器官”（血液系统、肝脏、脾脏、肺）受累。LCH临床分组依据病变累及器官的类型及数目，共分3组，Group-1：多系统疾病，并累及一个或多个危险器官；Group-2：多系统疾病，但未累及危险器官，初始6周诱导化疗有效；Group-3：单系统多灶性骨骼病变（≥2个骨骼病灶）和局部特殊部位病变（如中枢神经系统病变伴颅内软组织侵入、椎骨病变伴椎管内软组织侵入等）。
1.4 治疗方案及疾病状态评定标准患儿化疗参照LCH-Ⅲ诊疗方案[6]。其中Group-1总疗程为12个月；Group-2总疗程为6~12个月；Group-3总疗程为6个月，所有患儿诱导化疗的疗程和后续化疗的调整依据疗效反应评定结果，评定标准见表 1[5]。
| 表 1 朗格汉斯细胞组织细胞增生症治疗反应评定标准 |
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所有患儿均于化疗第6周、12周、25周、停药前，以及化疗结束1年内的每6个月、化疗结束1年后每年进行疾病状态评定。疾病状态评定参照2009版《朗格汉斯细胞组织细胞增生症评估与治疗指南》，具体见表 2[5]。
| 表 2 朗格汉斯细胞组织细胞增生症疾病状态评定标准 |
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所有患儿随访至2017年12月1日，中位随访时间19个月（5~50个月）。总生存期为确诊至随访终点或任何原因所致死亡的时间。无事件生存时间定义为确诊之日至事件（指复发、死亡及疾病进展）发生的时间。
1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理。非正态分布计量资料以中位数（范围）表示；计数资料采用率表示，两样本率的比较采用Fisher确切概率法；Kaplan-Meier方法计算患儿的2年总生存率（overall survival, OS）和2年无事件生存率（event-free survival, EFS）；生存率的组间比较采用log-rank检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 治疗结果与随访情况26例确诊后23例接受正规化疗；2例术后未化疗，复发后接受规范化疗；1例单系统非特殊部位单病灶患儿仅手术完全切除病灶，目前为非活动性疾病状态。至随访终点，26例患儿均存活，其中3例复发（术后未化疗的2例复发，1例于化疗结束后2次复发）；11例已完成化疗停药，14例处于维持化疗阶段，1例术后观察随访。患儿2年OS为100%，2年EFS为88%。
2.2 BRAF-V600E基因突变情况患儿的病理标本取自骨组织的18例，余8例来自淋巴结（3例）、皮肤（2例）、椎管内软组织（1例）、硬脑膜（1例）、乳突（1例），其中13例（50%）存在BRAF-V600E基因突变，11例BRAF-V600E基因突变阴性，2例BRAF-V600E基因突变可疑阳性。13例BRAF-V600E基因突变阳性病理标本中8例来自骨组织，2例来自皮肤，2例来自淋巴结，1例来自椎管内软组织。
2.3 BRAF-V600E基因突变与儿童LCH临床特征关系分析26例患儿中病变累及骨骼（23例，88%）、肺（7例，27%）、皮肤（5例，19%）、血液系统（5例，19%）、肝脏（3例，12%）、淋巴结（3例，12%）、脾脏（3例，12%）、中枢神经系统（2例，8%）及乳突（1例，4%）。26例患儿中SS-LCH 17例，MS-LCH 9例；7例为Group-1，2例为Group-2，17例为Group-3。
BRAF-V600E基因突变阳性与LCH临床分组相关（P=0.007），与患儿年龄、性别、受累器官、临床分类、早期治疗效果及复发均无相关性（P＞0.05）。见表 3。
| 表 3 BRAF-V600E基因突变阳性情况与儿童LCH临床特征的相关性 [例（%）] |
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截至随访终点，26例LCH患儿均存活，其中BRAF-V600E阳性组患儿复发1例（8%），BRAF-V600E突变阴性组复发2例（18%）。BRAF-V600E突变阳性与阴性组患儿的2年OS均为100%；而BRAF-V600E突变阳性组患儿2年EFS（90%）稍高于BRAF-V600E突变阴性组（86%），但差异无统计学意义（P=0.900）。
3 讨论LCH发病机制仍未完全阐明。近年大量研究显示，约50%以上LCH病例存在BRAF-V600E基因突变。而BRAF-V600E基因突变阴性的LCH病例中，仍有33%~50%患者存在MAP2K1基因突变[7-8]。此外，少部分LCH病例中存在MAPK信号通路的其他相关基因突变（如ARAF和ERBB3）[9]。因此目前认为，LCH是由于MAPK信号通路相关基因突变所致的髓系克隆增殖性肿瘤。
关于LCH患者BRAF-V600E阳性率，各研究中心的结果存在一定差异，这可能与样本选择、样本量及检测方法不同有关。北京儿童医院张莉等[10]采用二代基因测序方法检测了80例儿童LCH病理标本及血浆中BRAF-V600E基因突变情况，显示病理标本BRAF-V600E突变阳性率为68%，血浆标本BRAF-V600E阳性率为59%。本研究采用实时荧光定量PCR方法检测，LCH病理组织中BRAF-V600E突变阳性率为50%，略低于文献报道，而且2例为可疑阳性，因而对于BRAF-V600E突变可疑阳性病例可采用基因测序明确是否存在BRAF-V600E基因突变。
多项前瞻性临床试验表明，累及肝、脾、肺及造血系统的LCH患儿的死亡率显著升高，其中化疗12周后疾病仍进展者预后更差[6]。目前对BRAF-V600E基因突变能否作为儿童LCH危险度和预后预测的指标仍存在争议。国内外大多数研究未发现BRAF-V600E突变与儿童LCH临床危险度及预后相关[3, 10-11]。但Héritier等[12]对315例儿童LCH进行BRAF-V600E基因突变检测，发现多系统高危组患儿BRAF-V600E基因突变阳性率显著高于多系统低危组和单系统组，且BRAF-V600E基因突变阳性患儿对长春花碱及糖皮质激素更易产生耐药并显示更高的再活化率。Berres等[13]也发现BRAF-V600E基因突变阳性的LCH患儿更易出现治疗失败和复发。本研究也发现BRAF-V600E基因突变阳性情况与LCH临床分组相关；但与生存率无明显相关，可能与样本量偏小及随访时间短有关。
综上，本研究中一半的儿童LCH存在BRAF-V600E基因突变，提示部分LCH患儿的组织细胞呈克隆性生长，但BRAF-V600E基因突变与儿童LCH临床特征和预后关系仍不清楚，需进行更多前瞻性临床试验以明确。而BRAF-V600E基因突变的检出为靶向药物的临床应用提供了依据，部分临床试验[14-15]已证实BRAF抑制剂威罗菲尼成功挽救部分难治性LCH患者。因而深入研究BRAF-V600E基因突变将有助于认识儿童LCH的发病机制并改善其预后。
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