2018, Vol. 20
支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasis, BPD）是一种慢性肺部疾病，常见于长期氧疗、机械通气早产儿[1]。目前BPD发病机制尚未完全清楚，亦缺乏特异有效治疗手段。因此探讨BPD发病机制及防治手段，对指导临床治疗具有重要意义。
CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer-binding proteins, C/EBP）属碱性亮氨酸拉链蛋白转录因子超家族，现已发现6种C/EBP家族成员，包括C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε及C/EBPζ。其中，C/EBPα在妊娠晚期呼吸道上皮细胞成熟中起重要作用，并参与肺泡表面活性物质合成[2]。C/EBPα基因缺失新生小鼠在出生时即引起呼吸衰竭及肺结构成熟障碍[3]。
小泛素相关修饰物（small ubiquitin-related modifier, SUMO）化修饰是新近发现的一种蛋白质翻译后修饰。哺乳动物体内现已发现4种SUMO蛋白亚型，在肺脏中起主要调控作用的是SUMO1。相关研究表明，抑制SUMO特异性蛋白酶1可减轻急性肺损伤，提示SUMO化修饰可能对肺损伤发生发展起重要调节作用[4]。研究发现，C/EBPα可被SUMO化修饰，C/EBPα序列中协同调控基序SCM（synery control motifs）为SUMO结合位点。文献报道，C/EBPα的SUMO化修饰导致肝细胞增殖抑制功能失活，并抑制C/EBPα抗有丝分裂能力[5]。在SUMO敲除胚胎中，加入SUMO-C/EBPα融合蛋白可恢复正常造血功能[6]。目前，有关C/EBPα的SUMO化修饰研究较少，本课题组前期研究表明，在肺发育过程中，C/EBPα的SUMO化修饰可能与肺分化、肺泡表面活性蛋白表达及磷脂酰胆碱分泌息息相关，提示SUMO化修饰参与C/EBPα介导的分化与增殖[7]。但C/EBPα的SUMO化修饰是否影响高氧暴露所致早产大鼠肺组织细胞分化及增殖，是否参与了BPD的病理生理过程，目前尚不明确。本研究以高氧暴露所致早产大鼠BPD模型为对象，探索SUMO化修饰C/EBPα在BPD中的表达及其动态改变与肺分化及增殖的关系。
1 材料与方法 1.1 实验材料RIPA裂解液（强）、NP40裂解液（上海碧云天生物技术有限公司），SDS-PAGE配胶试剂盒（长沙艾佳生物技术有限公司），兔抗大鼠SUMO1单克隆抗体、兔抗大鼠Ki67多克隆抗体（Abcam公司，美国），山羊抗大鼠C/EBPα多克隆抗体（Santa cruz公司，美国），小鼠抗大鼠β-actin多克隆抗体（CST公司，美国），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔单克隆IgG、兔抗山羊单克隆IgG、山羊抗鼠单克隆IgG（CST公司，美国），ECL检测试剂盒（Millipore公司，美国），预染蛋白Marker（Fermentas公司，立陶宛），Protein A/G Plus-Agarose（Santa cruz公司，美国），糖原PAS染色试剂盒（Solarbio公司，美国）。
1.2 高氧暴露早产大鼠BPD模型建立及分组Sprague-Dawley（SD）孕鼠孕19 d（预产期为22 d）行剖宫产，提前娩出的新生大鼠为早产鼠。将早产鼠随机分为空气组及高氧组；利用高氧暴露复制BPD模型[8]，高氧组大鼠置于氧箱中，氧浓度维持在85%，空气组大鼠置于同一室内常压空气中；代母鼠每24 h在空气组和高氧组间更换一次，以避免氧中毒并排除不同组间代母鼠的影响，每日观察大鼠情况并记录。分别于空气或高氧暴露后4 d、7 d及14 d每组各取3只大鼠麻醉，气管插管，4%多聚甲醛气管内注射原位固定，取出肺组织，左肺用于制作石蜡切片，观察肺组织形态，右肺组织冰冻保存用于相关蛋白检测。
1.3 糖原染色检测肺组织分化取标本切片以过碘酸雪夫氏染色法（PAS）处理，切片脱腊至水，室温置于过碘酸溶液中10 min，Schiff Reagent溶液反应至变色后双蒸水冲洗，苏木素染核，光镜下观测，IPP软件评估组织中糖原含量，了解肺细胞分化情况。
1.4 免疫组化技术检测肺组织中Ki67表达以细胞增殖标记物Ki67观察肺组织细胞增殖情况。切片常规脱蜡至水，抗原修复后血清封闭30 min，滴加兔抗大鼠Ki67多克隆一抗（1 : 500），4℃过夜，PBS充分洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔单克隆IgG，室温孵育30 min，DAB显色，苏木素染核，1%盐酸乙醇分化返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶固定封片后镜下观察，IPP软件分析Ki67表达量，了解肺细胞增殖情况。
1.5 Western blot技术检测肺组织中SUMO1及C/EBPα蛋白表达RIPA裂解液（含PMSF、蛋白酶抑制剂）提取各组肺组织细胞总蛋白，按每泳道取15 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿式电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉37℃封闭1 h后，分别加入兔抗大鼠SUMO1单克隆抗体（1 : 1 000）、山羊抗大鼠C/EBPα多克隆抗体（1 : 1 000）、小鼠抗大鼠β-actin多克隆抗体（1 : 1 000）一抗，4℃孵育过夜。洗膜，以辣根过氧化物酶标记的单克隆IgG（1 : 5 000）孵育1 h，ECL化学发光显色。以目的蛋白与β-actin条带积分吸光度的比值表示目的蛋白相对表达水平。
1.6 免疫共沉淀技术（CO-IP）检测肺组织中SUMO化C/EBPα表达利用NP40裂解液（含PMSF、NEM和蛋白酶抑制剂）分别提取各组肺组织细胞总蛋白，4℃12 000 r/min离心取上清。取20 µL裂解液作为input，加入5×SDS电泳上样缓冲液煮沸10 min，用于检测免疫沉淀的蛋白量。向剩余裂解液中加入0.5 µg山羊抗大鼠C/EBPα多克隆抗体（1 : 100），4℃温和摇摆4 h，加入20 µL protein A/G beads，4℃孵育过夜，2 500 r/min离心，去上清，反复洗涤后加5×SDS电泳上样缓冲液煮沸，后续参照上述操作行SUMO1的免疫印迹实验，了解SUMO化C/EBPα表达情况。实验结果以SUMO化C/EBPα与β-actin的比值表示。
1.7 统计学分析采用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（ x±s）表示，两组样本间比较采用t检验；组内各时间点比较采用单因素方差分析，两两时间点比较采用SNK-q检验；两样本间相关性采用Pearson相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 肺组织分化情况肺上皮细胞内糖原经过PAS染色后呈紫红色，定位在胞浆。空气组大鼠肺组织糖原染色强度在生后逐渐减弱；与同时间点空气组相比，高氧组糖原染色强度4 d时减弱，7 d时增强，14 d时肺泡上皮细胞以立方上皮为主，胞浆内糖原染色强度明显增强。见图 1。
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图 1 糖原染色检测两组大鼠肺组织分化情况（PAS，×200） 空气组糖原染色强度随时间递减。与空气组比较，高氧组4 d时糖原染色强度减弱，7 d及14 d逐渐增强，提示肺损伤晚期存在肺泡上皮细胞分化成熟障碍。糖原染色后呈紫红色。 |
Ki67阳性信号表现为定位于胞核的棕黄色颗粒，主要表达在呼吸道和肺泡上皮细胞，肺泡间隔内也可见表达。空气组Ki67于4 d时表达最弱，以后逐渐增加；高氧组肺组织中Ki67表达呈逐渐升高趋势，且均高于同时间点空气组。见图 2。
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图 2 免疫组化检测肺组织Ki67表达（DAB，×200；左下角方框内，×400） 空气组Ki67表达随时间逐渐增加；高氧组随时间亦呈升高趋势，且均高于同时间点空气组。Ki67阳性信号表现为定位于胞核的棕黄色颗粒。 |
Western blot结果表明，空气组SUMO1蛋白表达在各个时间点比较差异无统计学意义（P > 0.05）。随高氧暴露时间延长，高氧组SUMO1蛋白表达呈逐渐上升趋势（P < 0.05），且均明显高于同时间点空气组（P < 0.05）。空气组与高氧组C/EBPα蛋白表达均呈逐渐下降趋势（P < 0.05）；与空气组相比，高氧组4 d时C/EBPα蛋白表达增加，7 d及14 d时表达降低（P < 0.05）。见图 3~5及表 1。
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图 3 Western blot检测C/EBPα、SUMO1蛋白表达 1：空气组4 d；2：高氧组4 d；3：空气组7 d；4：高氧组7 d；5：空气组14 d；6：高氧组14 d。 |
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图 4 两组各时间点SUMO1蛋白表达比较（n=3） a示与同组4 d比较，P < 0.05；b示与同时间空气组比较，P < 0.05。 |
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图 5 两组各时间点C/EBPα蛋白表达比较（n=3） a示与同组4 d比较，P < 0.05；b示与同组7 d比较，P < 0.05；c示与同时间空气组比较，P < 0.05。 |
| 表 1 两组各时间点C/EBPα及SUMO1蛋白相对表达量比较 （x±s，n=3） |
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CO-IP结果显示，生后4 d、7 d及14 d时，空气组SUMO化C/EBPα表达量少，但随着时间延长逐渐增加（P < 0.05），14 d时表达水平高于4 d及7 d时；高氧组SUMO化C/EBPα表达呈逐渐上升趋势（P < 0.05），14 d时表达水平高于4 d时，且均明显高于同时间点空气组（P < 0.05）。见图 6~7及表 2。
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图 6 CO-IP检测SUMO化C/EBPα蛋白表达 |
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图 7 两组各时间点SUMO化C/EBPα蛋白相对表达量比较（n=3） a示与同组4 d比较，P < 0.05；b示与同组7 d比较，P < 0.05；c示与同时间空气组比较，P < 0.05。 |
| 表 2 两组各时间点SUMO化C/EBPα蛋白相对表达量比较（x ±s，n=3） |
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高氧暴露BPD模型中，肺组织SUMO化C/EBPα表达与糖原染色强度及核增殖抗原Ki67表达均呈正相关（r=0.529、0.671，均P < 0.05）。见图 8~9。
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图 8 SUMO化C/EBPα表达与糖原含量相关分析图 |
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图 9 SUMO化C/EBPα表达与Ki67表达相关分析图 |
Pan等[9]利用新生大鼠BPD模型研究发现，BPD组大鼠肺泡间隔中断增多，肺泡分化阻滞。糖原富集于不成熟肺泡上皮细胞内，随着肺发育，糖原逐渐消耗，当肺泡上皮细胞分化受阻时出现糖原累积，因此糖原代谢情况可作为肺分化重要参考指标之一。本实验研究结果显示，高氧暴露后，早产大鼠发生肺泡数目减少，体积变大，肺泡结构简单化等改变，与BPD病理改变相似。高氧肺损伤晚期，肺泡上皮细胞内糖原堆积，提示高氧可致肺泡上皮细胞分化成熟障碍。与同时间点空气组比较，高氧组Ki67表达均明显增加，说明高氧诱导肺组织细胞增殖。
近年研究发现，C/EBPα作为调节细胞增殖与分化的关键转录因子，在呼吸道上皮细胞增殖和分化过程中发挥至关重要作用，并参与肺泡表面活性蛋白（surfactant protein, SP）、板层小体相关蛋白及前体脂肪酸的合成，维持肺功能稳态[10]。利用原代培养肺泡上皮细胞（AEC）Ⅱ高氧暴露细胞损伤模型，前期研究发现[11]，高氧暴露后C/EBPα表达呈先增加后减少趋势，提示C/EBPα在损伤早期可能通过代偿增加参与保护性应激机制，而随着损伤加重，最终表现为后期失代偿。本实验研究结果显示，在高氧暴露BPD模型中，4 d时C/EBPα表达增加，Torres等[12]发现高氧环境下，早期肺组织中SP-A及SP-B mRNA表达增加，与C/EBPα表达时空一致，提示早期肺损伤时C/EBPα代偿性增加可能通过上调SP表达，保护肺泡上皮细胞。随着高氧暴露时间延长，C/EBPα表达减少，肺泡上皮细胞以立方上皮为主，肺泡上皮细胞内糖原堆积，提示AECⅡ向AECⅠ分化障碍，肺泡化不能顺利完成，C/EBPα表达减少与肺组织发育成熟障碍趋势一致，提示高氧暴露导致的肺分化障碍与C/EBPα表达减少有关。
SUMO化修饰可通过与目标靶蛋白结合发挥调节作用，并与许多肺脏疾病的发生发展有所关联。低氧肺动脉高压大鼠模型中，SUMO1 mRNA及蛋白表达均升高，提示SUMO1可能在低氧肺动脉高压中发挥作用[13]。本实验研究结果显示，高氧组大鼠肺组织中SUMO1表达较空气组显著增加，且随高氧暴露时间延长而逐步升高，提示SUMO1过表达可能参与BPD发生发展。研究发现，C/EBPα可发生SUMO化修饰，SUMO1可修饰C/EBPα Lys159的赖氨酸残基，并抑制其转录活性[14-15]。Hankey等[16]证实，在嗜中性粒细胞发育过程中，C/EBPα的SUMO化修饰水平改变可能有助于调节其转录活性。另外，Sato等[5]发现，SWI/SNF染色质重塑复合物BRG1可增强C/EBPα介导的反式激活，而SUMO化修饰可抑制此过程减少C/EBPα转录。前期研究发现，肺发育过程中，随着肺分化，SUMO化C/EBPα表达逐渐降低，并与肺表面活性物质表达呈负相关，暗示SUMO化修饰可能抑制C/EBPα介导的肺分化[7]。本实验中，高氧肺损伤早期，C/EBPα及SUMO化C/EBPα表达均增加，随着氧暴露时间延长，SUMO化C/EBPα继续呈现增加趋势，而C/EBPα表达降低，提示SUMO化修饰可能抑制C/EBPα的转录活性，导致后期C/EBPα表达量减少。为进一步明确SUMO化C/EBPα是否与BPD肺分化障碍有关，利用相关分析，本研究发现，高氧暴露下，SUMO化C/EBPα表达与糖原含量呈正相关，提示SUMO化C/EBPα可能与BPD中肺泡分化阻滞存在密切关系。
已有研究表明，C/EBPα是一种强有力的细胞增殖抑制剂[17]，C/EBPα缺陷新生小鼠AECⅡ增殖旺盛[18]。SUMO化修饰可破坏C/EBPα与其他蛋白质相互作用，从而减少增殖抑制复合物形成[19]，促进细胞增殖。本实验中，生理状态下SUMO化C/EBPα表达量极低，高氧暴露后SUMO化C/EBPα表达明显增加，且随高氧暴露时间延长，SUMO化C/EBPα表达逐渐升高，并与Ki67表达呈显著正相关，进一步证明高氧下SUMO化C/EBPα表达增加，可能钝化C/EBPα介导的增殖抑制，促进细胞增殖。
综上所述，高氧暴露所致早产大鼠BPD中，肺泡上皮细胞过度增殖与分化障碍可能与SUMO化C/EBPα表达增加相关。应用基因敲除技术或拮抗剂抑制SUMO功能，或调控SUMO化修饰C/EBPα水平，对于高氧暴露所致BPD肺损伤是否具有保护作用有待进一步研究。
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