2018, Vol. 20
2. 深圳市光明新区人民医院新生儿科, 广东 深圳 518106
支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia, BPD）是常见于早产儿的慢性肺部疾病。该病治疗周期长，治愈率低，严重者常遗留肺功能障碍、生长发育迟缓等多种远期并发症，给家庭和社会造成沉重负担。
BPD的致病因素错综复杂，发病机制亦尚未完全阐明。然而，随着针对该病的临床和实验研究的不断深入，发现氧化应激和炎症反应在BPD的发生发展中发挥重要作用[1-2]。机械通气和氧疗是BPD患儿的常见治疗手段。新生儿尤其是未成熟早产儿，肺组织发育不完善，对氧化应激更为敏感，且抗氧化能力较弱。因此，长期氧疗极易导致患者肺部损伤。细胞经过高氧刺激可产生大量活性氧簇（reactive oxygen specie, ROS），引发脂质过氧化反应，最终导致细胞结构和功能的异常[3]。另外，炎症在BPD的发生发展中扮演重要角色。目前认为，不成熟肺暴露于高氧后，炎症细胞聚集于肺部，释放大量炎症因子，触发炎症级联反应，最终可导致BPD患儿肺组织结构的异常发育[4]。
近年来，中药大黄被广泛应用于实验研究，认为其可通过抑制机体氧化应激水平，减少炎症因子的分泌，防治急性肺损伤[5]。大黄素可通过抑制核因子-κB的活性，减轻脂多糖介导的急性肺损伤，减少支气管肺泡灌洗液中炎症细胞和前炎性因子的水平[6]。另有研究发现，大黄可通过降低丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平，提高谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）的水平，改善百草枯中毒大鼠的肺损伤[7]。而大黄对BPD的保护作用目前尚未见报道。本课题组假设在高氧致新生大鼠BPD模型中，大黄可以通过抑制肺组织中氧化应激及炎症反应发挥保护作用。因此，本研究拟建立60%高氧致新生大鼠BPD动物模型，探讨大黄对BPD的影响。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂Sprague-Dawley（SD）大鼠由南方医科大学实验动物中心提供[动物许可证号：SCXK（粤）2011-0015]。大黄提取物（湖北盛天恒创公司）。MDA、SOD检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。RNA提取试剂盒、实时荧光定量PCR（real-time PCR）试剂盒（TaKaTa，日本）。全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒（南京凯基公司）。小鼠抗大鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha, TNF-α）多克隆抗体（Abcam，英国），兔抗大鼠白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）多克隆抗体、兔抗大鼠GAPDH多克隆抗体（Affinity，美国）。
1.2 动物模型制备动物模型制备参考文献[8-9]：将64只生后4 d SD大鼠，按随机数字表法分成空气对照组、大黄对照组、高氧模型组、高氧+大黄组，每组16只。两高氧组大鼠暴露于60%氧浓度中构建BPD模型，温度维持于25~26℃，CO2浓度 < 0.5%，湿度50%~70%；两对照组大鼠暴露于空气中，余实验条件同高氧组。造模同时，大黄对照组及高氧+大黄组每天给予大鼠600 mg/kg大黄提取物混悬液灌胃1次，其余两组予以等量生理盐水灌胃。
1.3 标本的采集和处理生后第14、21天，每组分别随机抽取8只SD大鼠，行腹腔注射麻醉后，立即打开胸腔，分离周围组织，暴露支气管，结扎右支气管；取右肺速冻于液氮中，而后转移至-80℃冰箱保存，用于肺组织中SOD活性、MDA水平的检测，以及RNA和蛋白的提取；取左肺经4%多聚甲醛溶液固定过夜后，行逐级酒精脱水、透明、浸蜡、包埋制成石蜡切片（厚5 μm），用于苏木素-伊红（hematoxylin-easine, HE）染色。
1.4 肺组织形态学观察石蜡切片经HE染色后，光学显微镜下观察各组大鼠肺组织形态学改变。放射状肺泡计数（radical alveolar counts, RAC）评估肺泡发育程度：从呼吸性细支气管的中心，绘制垂直线到最近的胸膜，并且计算与该线相交肺泡数即为RAC。每组取8只大鼠标本，每个标本随机取5张切片，每张切片随机观察5个视野。
1.5 肺组织中SOD活性、MDA水平的检测取肺组织4℃匀浆制成10%匀浆液后，离心取上清，BCA法检测蛋白浓度，遵循试剂盒说明书，采用分光光度计法测定SOD活性及MDA水平。
1.6 肺组织中TNF-α、IL-6 mRNA表达水平的检测采用real-time PCR法检测mRNA的表达。提取肺组织RNA后，采用紫外分光光度计测定RNA的纯度及浓度。遵循TaKaTa试剂盒操作说明，行逆转录合成cDNA单链。TNF-α、IL-6以及GAPDH引物均由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成，TNF-α引物序列：上游：5' -GAGCATCGTAG-TTGTTGGAAAT-3' ，下游：5' -CAGGTCTACTTTGG-AGTCATTG-3' ，片段长度：210 bp；IL-6引物序列：上游：5' -TACTGGTCTGTTGTGGGTGGT-3' ，下游：5' -TTGCCTTCTTGGGACTGATGT-3' ，片段长度：101 bp；GAPDH引物序列：5' -TCTCTGCTCCTCCC-TGTTC-3' ，下游：5' -ACACCGACCTTCACCATCT-3' ，片段长度：87 bp。反应体系（20 μL）：上、下游引物各0.5 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，cDNA单链模板2 μL，ddH2O 7 μL。反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环。于罗氏480仪器上行RT-PCR反应后收集数据，采用2-△△CT相对定量法进行计算。
1.7 肺组织中TNF-α、IL-6蛋白表达水平的检测采用Western blot法检测蛋白的表达。提取肺组织总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。将蛋白与上样缓冲液以1 : 4的比例混合，煮沸5 min，使其变性；变性蛋白经电泳、转膜，5% BSA室温封闭1 h，加入一抗（TNF-α抗体浓度1 : 500，IL-6抗体浓度1 : 1 000，GAPDH抗体浓度1 : 3 000）4℃孵育过夜；洗膜，再加入HRP标记的二抗（抗体浓度1 : 3 000）室温孵育1 h；洗膜，最后经ECL化学发光后采集图像。利用Image J软件对各组条带行灰度值分析，以目的蛋白与GAPDH的比值作为该目的蛋白的半定量结果。
1.8 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠肺组织形态学改变在生后第14、21天，空气对照组与大黄对照组大鼠肺组织结构完整，肺泡大小均匀，间隔无明显破坏，并随日龄增加，大鼠肺形态学发育逐渐成熟。高氧模型组于生后14 d可见肺泡间隔厚薄不均，肺泡数量明显减少；于生后21 d可见肺组织发育进一步受阻，肺泡数量减少的同时，体积明显增大，结构简单化，形成肺大疱；且肺组织形态学测量指标RAC在两时间点均明显低于空气对照组及大黄对照组（P < 0.01）。相比高氧模型组，高氧+大黄组大鼠肺组织病理改变于两时间点均明显减轻，RAC也相应增加（P < 0.05）。见图 1，表 1。
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图 1 各组大鼠肺组织形态学改变（苏木精-伊红染色，×400） 空气对照组和大黄对照组大鼠随日龄增加肺组织结构发育渐成熟，肺泡结构规整，间隔较薄。高氧模型组大鼠于生后14 d时可见肺泡数量减少，体积增大；于生后21 d时可见肺泡数目明显减少，结构简单化，肺泡壁破裂融合形成肺大疱。与高氧模型组比较，高氧+大黄组病理改变显著减轻，肺泡数目增多，肺泡结构较完整。 |
| 表 1 各组大鼠放射状肺泡计数比较 （x±s） |
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与空气对照组、大黄对照组相比，高氧模型组大鼠生后14、21 d时SOD活性明显降低（P < 0.05），MDA水平明显升高（P < 0.01）。与高氧模型组比较，高氧+大黄组大鼠SOD活性于两时间点显著升高（P < 0.01），MDA水平显著降低（P < 0.05）。见表 2。
| 表 2 各组大鼠肺组织中SOD活性和MDA水平比较 （x±s） |
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在生后第14、21天，空气对照组与大黄对照组TNF-α、IL-6 mRNA及其蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）。与空气对照组、大黄对照组比较，高氧模型组TNF-α、IL-6 mRNA及其蛋白表达水平于两时间点均明显升高（P < 0.01）。与高氧模型组比较，高氧+大黄组TNF-α、IL-6 mRNA及其蛋白表达水平于生后14、21 d时均明显降低（P < 0.05）。见表 3~4，图 2~4。
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图 2 各组大鼠肺组织TNF-α mRNA相对表达量（n=8） a示与空气对照组比较，P < 0.01；b示与大黄对照组比较，P < 0.01；c示与高氧模型组比较，P < 0.01。 |
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图 3 各组大鼠肺组织IL-6 mRNA相对表达量（n=8） a示与空气对照组比较，P < 0.01；b示与大黄对照组比较，P < 0.01；c示与高氧模型组比较，P < 0.05；d示与高氧模型组比较，P < 0.01。 |
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图 4 Western blot检测各组大鼠肺组织TNF-α和IL-6蛋白表达 1：空气对照组；2：大黄对照组；3：高氧模型组；4：高氧+大黄组。 |
| 表 3 各组大鼠肺组织中TNF-α mRNA和蛋白表达水平比较 （x±s） |
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| 表 4 各组大鼠肺组织中IL-6 mRNA和蛋白表达水平比较 （x±s） |
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近年来，随着围生医学的快速发展和新生儿救治技术的不断提高，如产前糖皮质激素的使用、产后肺表面活性物质的替代治疗等，使得早产儿生存率增加的同时BPD的发病率也显著增加。BPD的主要病理特征是肺泡和微血管的发育不良[10]。有研究经过长期随访发现，生命早期肺功能发育受阻的BPD患儿，存活后其呼吸道对外界刺激的敏感性明显增加，且成年后更易罹患慢性阻塞性肺疾病[11]。因此，寻求更为有效的治疗手段显得极为重要。本研究将生后4 d SD大鼠暴露于60%高氧中构建BPD模型，暴露于高氧后的大鼠肺组织形态出现明显异常，肺泡数目减少，体积增大，肺组织结构简单化，RAC减少，并随时间的延长损伤加重，甚至出现肺大疱，表明高氧致新生大鼠BPD动物模型构建成功。经大黄干预后，上述病理损伤得到明显改善，提示大黄可减轻高氧诱导的肺损伤。
有研究认为，氧化和抗氧化系统的失衡是BPD的发病机制之一[1]。MDA是脂质过氧化的主要代谢产物，机体内MDA的水平作为细胞氧化损伤的一个重要检测指标，可反映组织氧化损伤的程度。SOD是机体内主要的抗氧化酶，可以清除氧自由基，检测SOD的活性可以反映体内抗氧化水平[12]。Xu等[13]将新生鼠暴露于90%高氧14 d后发现肺组织中MDA水平明显增加，而SOD活性及GSH水平明显降低。本研究同样发现，相比空气对照组，未经药物干预的高氧模型组大鼠肺组织中SOD活性降低，MDA水平升高，证实高氧可通过诱导机体氧化和抗氧化的失衡引起BPD肺损伤。
文献报道[2]，在肺发育的关键时期，由感染、机械通气、氧疗等引起的肺部炎症反应可导致肺泡数量减少，结构简单化和气体交换面积的减少。TNF-α、IL-6是一类主要由巨噬细胞分泌的前炎症细胞因子，可介导机械通气相关性肺损伤[14]。Hsiao等[15]发现，BPD患儿生后第1天血清及气管吸出物中IL-6和8-羟基-2' -脱氧鸟苷的水平明显高于正常早产儿，并且气管吸出物中两者的水平在生后第28天仍持续增加。早产儿气管吸出物中高水平的IL-6被认为是BPD的独立危险因素[16]。本实验结果发现，高氧暴露14 d、21 d时大鼠肺组织中TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白的表达水平较两对照组均明显升高，提示高氧诱导BPD模型大鼠肺组织中出现明显的炎症反应。
大黄为常用中药，多用于治疗腹痛、便秘等临床症状。近年来越来越多的研究发现，大黄具有减轻氧化应激和炎症反应、改善微循环障碍以及维持免疫平衡等广泛的药理作用[17]。本实验结果表明，生后4 d SD大鼠暴露于60%高氧后，肺组织发育明显受阻。与此同时，与空气对照组相比，高氧模型组大鼠肺组织中炎症细胞因子TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白的表达水平、脂质过氧化产物MDA水平均明显升高，抗氧化酶SOD活性明显降低。高氧组大鼠给予大黄后，炎症因子及氧化应激水平均明显降低，且高氧诱导的肺组织损伤也得到明显改善。
综上所述，大黄可能通过减少炎症因子水平，抑制氧化应激反应发挥BPD大鼠的肺组织保护作用。因此，本研究为临床大黄防治BPD提供了一定的实验基础。
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