2018, Vol. 20
急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）是儿童最常见恶性肿瘤，其中B细胞ALL（B-ALL）约占儿童ALL的80%，随着治疗的进步，80%左右可长期无病生存[1]。但仍有15%~20%的B-ALL复发，这与体内的残留白血病细胞即微小残留病（minimal residual diseas, MRD）有关[2]。在ALL的现代分层治疗中，MRD是危险分层的重要指标，可作为一个独立的预后参数，诱导缓解第33天是MRD监测的重要时间点[3-4]。中国儿童白血病协作组（Chinese Children's Leukemia Group, CCLG）ALL-2008方案将第33天MRD作为危险分层的一个独立参数，第33天MRD阳性是B-ALL患儿的高危因素[5-6]。IKZF1（Ikaros family zinc finger 1）基因的编码蛋白Ikaros属于锌指DNA结合蛋白家族，参与染色质重塑，发挥调控淋巴细胞分化发育，是淋巴系统发育必需的转录因子。Ikaros基因包含结合DNA的N端4个锌指结构，以及形成二聚体的C端2个锌指结构。IKZF1基因含8个外显子，可产生10余种亚型，只有N端含有至少3个锌指结构的亚型（IKl-IK3）才能与DNA正确结合而正常发挥功能，因此IKl-IK3被认为是功能亚型，而其他亚型为显性负向Ikaros异构体，即功能缺失亚型。IKZF1基因功能缺失亚型的表达与儿童ALL预后不良相关[7]。而关于IKZF1基因型联合诱导缓解第33天MRD对B-ALL儿童预后的预测鲜有报道。本研究通过巢式逆转录聚合酶链反（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）方法检测儿童B-ALL患者IKZF1基因亚型表达，并应用流式细胞术检测第33天MRD水平，以探讨第33天MRD及IKZF1基因型对于生存的影响。
1 资料与方法 1.1 研究对象收集湖南省儿童医院血液内科2012年1月至2015年6月第一疗程化疗获得完全缓解且有完整随访信息的152例初诊B-ALL患者的临床资料，均经骨髓细胞形态学、免疫学分型、细胞遗传学和分子生物学确诊，诊断、疗效评价、复发均参照《血液病诊断及疗效标准》[8]，并按CCLG-ALL-2008方案治疗[6]。其中男88例、女64例，平均年龄6.25岁。随访截至2017年8月1日，中位随访时间35（14~68）个月，随访期间2例因严重感染死亡，26例复发。无复发生存期指从完全缓解（complete remission, CR）至第一次复发的时间。
本研究获得患儿家长的知情同意。
1.2 染色体、融合基因和MRD检测染色体、融合基因和MRD检测均由武汉康圣达医学检验所完成。危险度分组参照CCLG-ALL-2008方案[6]标准。并以第33天MRD作为危险分层的依据，残留白血病细胞 < 10-4者为MRD标危组（60例），10-4≤MRD < 10-2为MRD中危组（55例），MRD≥10-2为MRD高危组（37例）。
1.3 巢式RT-PCR检测IKZF1基因亚型表达收集化疗前的骨髓单个核细胞，用TRIzol法提取总RNA，逆转录合成cDNA。利用Primer Premier 6软件设计PCR引物，引物合成委托美国Invitrogen公司完成。内参基因GAPDH引物上游5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，扩增片段长度226 bp。IKZF1基因巢式PCR引物能够扩增IKZF1所有亚型，外引物上游5'-ATGGATGCTGATGAGGGTCAAGAC-3'，下游5'-TTAGCTCATGTGGAAGCGGTGCTC-3'；内引物上游5'-CCCCTGTAAGCGATACTCCAGATG-3'，下游5'-GATGGCTTGGTCCATCACGTGGGA-3'。第一轮PCR反应体系为20 μL，包括2×GoTaq Green Master Mix 10 μL、外侧上游和下游引物1.5 μL、cDNA 1.5 μL、ddH2O 7 μL，ddH2O做阴性对照。PCR条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环后72℃延伸7 min，4℃终止反应。取第一轮PCR扩增产物0.5 μL与9.5 μL ddH2O混合，从中吸取1.5 μL进行第二轮PCR。第二轮PCR反应体系为20 μL，包括2×GoTaq Green Master Mix 10 μL、外侧上游和下游引物各1.5 μL、第一轮PCR扩增产物1.5 μL、ddH2O 7 μL，用ddH2O做阴性对照。PCR条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环后72℃延伸7 min，4℃终止反应。取最终扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳，利用紫外成像仪成像分析，电泳产物进行切胶回收测序鉴定：IKl-IK3为功能亚型，而缺乏IKl-IK3亚型为功能缺失亚型。上述实验由武汉康圣达医学检验所完成。
1.4 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行数据处理。计数资料以频数或百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier方法评估患儿5年无复发生存率，无复发生存率的组间比较采用log-rank检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 B-ALL患儿中IKZF1基因亚型的表达152例B-ALL患儿的IKZF1基因型有7种亚型（图 1）：IK1（945 bp）、IK2/3（684 bp）、IK4（558 bp）、IK6（225 bp）、IK8（390 bp）、IK9（135 bp）和IK10（95 bp），并经过测序鉴定证实。130例（86%）儿童B-ALL患者表达IKZF1功能亚型，22例（14%）表达IKZFl功能缺失亚型。
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图 1 巢式PCR方法检测B-ALL患儿IKZF1基因表达情况 注：M泳道为marker，第l、8泳道945 bp处的明显条带为IK1亚型，第2泳道684 bp处的明显条带为IK2/3亚型，3泳道390 bp处的明显条带为IK8亚型，第4、9泳道225 bp处的明显条带为IK6亚型，第5、6泳道558 bp处的明显条带为IK4亚型，7泳道135 bp处的明显条带为IK9亚型，9泳道95 bp处的明显条带为IK10亚型。 |
152例患儿随访期间复发26例（17%），自诊断至复发的中位时间为28（6~62）个月。随着MRD水平增高，复发率逐渐增高，以MRD高危患儿复发率最高（P < 0.05），而标危、中危组复发率的差异无统计学意义（P > 0.05），见表 1。
| 表 1 MRD水平对B-ALL患儿复发的影响 [例（%）] |
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表达IKZF1基因功能缺失亚型的患儿复发率高于表达IKZFl功能亚型的患儿（P < 0.01），见表 2。
| 表 2 IKZF1基因亚型对B-ALL患儿复发的影响 [例（%）] |
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152例B-ALL患儿5年无复发生存率为（82.5±1.8）%，第33天MRD标危、中危和高危组的5年无复发生存率分别为（94.2±2.9）%、（86.7±3.8）%和（56.2±4.5）%，三组间的差异有统计学意义（P < 0.05）；表达IKZF1基因功能亚型的患儿其5年无复发生存率[（89.6±2.7）%]高于表达功能缺失亚型的患儿[（31.3±3.9）%]，差异有统计学意义（P < 0.01）。见图 2。
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图 2 MRD分组及IKZF1基因亚型对B-ALL患儿5年无复发生存率的影响 |
诱导化疗第33天MRD标危组中表达IKZF1基因功能亚型或功能缺失亚型的患儿5年无复发生存率分别为（96.4±2.5）%和（75.8±3.6）%，差异无统计学意义（P=0.058）；中危组及高危组表达IKZF1基因功能亚型的患儿5年无复发生存率[（95.3±2.2）%，（67.7±2.6）%]高于表达功能缺失亚型的患儿[（58.3±3.2）%，（14.3±1.5）%]，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 3。
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图 3 MRD危险分组与IKZFl基因型联合对于B-ALL患儿无复发生率的预测 A：MRD标危组；B：MRD中危组；C：MRD高危组。 |
近年来，儿童B-ALL的疗效取得很大进步，但复发仍是导致治疗失败的最主要原因，我国儿童ALL的累计复发率为15%左右[9]。本研究B-ALL的累计复发率为17.1%。B-ALL的高复发率对危险度分级提出了挑战。MRD监测在儿童ALL的疗效和预后评价方面具有重要价值，将MRD引入到传统的危险分层形成一种新的分层体系，能更好地判断ALL预后、优化治疗方案、提高治愈率[10]。
诱导缓解第33天的MRD具有重要的预后意义。Pui等[11]研究显示，在诱导缓解后MRD阴性的382例ALL中6例（1.6%）复发，而MRD阳性的11例患者2例（18.2%）复发。安粉艳等[6]报道第33天MRD≥10-2是B-ALL患儿5年无事件生存率和总生存率显著减低的高危因素。因此一些医疗机构已将第33天MRD引入白血病危险分层以指导治疗[5, 12]。刘晓明等[5]应用第33天MRD调整危险度并进行相应强度化疗，患儿严重感染的发生率没有增加，但复发率及病死率降低。Vora等[12-13]进行的随机对照试验显示，诱导结束时MRD < 0.01%和MRD为0.01%~0.1%的患者5年EFS分别为（87±1）%和（74±4）%，对MRD阳性患者采用更强的治疗方案可改善预后。本研究根据第33天MRD水平进行B-ALL危险分层，结果显示高危患儿复发率高于标危和中危。
IKZF1基因是与淋巴细胞发育相关的重要转录因子，编码产生IKAROS蛋白，参与造血细胞的分化发育，尤其在淋巴系统发育与肿瘤抑制中起关键作用[14]。
近年来发现部分复发ALL儿童存在IKZF1基因的缺失和突变。而IKZFl基因缺失突变主要表现为显性负向亚型即功能缺失亚型的表达，如IK6等表达。IKZF1基因缺失被证实是ALL预后不良因素[15]。研究表明IKZFl基因功能亚型的缺失与成人ALL早期复发与耐药有关[16]。黄小航等[17]报道IK6亚型（IKZFl基因功能缺失亚型）的表达可作为儿童B-ALL预后不良的标志，与B-ALL复发密切相关。本研究显示，存在IKZFl基因功能缺失亚型患儿的累计复发率高于IKZFl基因功能亚型阳性患儿，其5年无复发生存率也较低，与文献报道相似。虽然，MRD预后分层可识别出治疗反应差的B-ALL患者，但仍有部分MRD中危的患者出现复发。因此，目前的MRD预后分层系统不能真正反映患者复发风险。本研究将诱导缓解第33天MRD和IKZFl基因型联合，分析两者对于儿童B-ALL无复发生存率的共同影响。结果提示，第33天MRD标危组中存在IKZF1基因功能亚型患儿的5年无复发生存率与功能缺失亚型阳性患儿的差异无统计学意义，中危组和高危组中存在IKZF1基因功能亚型患儿的5年无复发生存率均高于功能缺失亚型阳性患儿，提示IKZF1功能缺失亚型B-ALL患儿若同时存在高水平MRD则复发率很高，预后非常差，有必要调整或探求新的治疗方案。
总之，将MRD联合IKZF1基因表达进行ALL的预后分层，可能为B-ALL患儿的个体化治疗提供更多依据。
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