肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, MP）是儿童社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia, CAP）的重要病原之一，MP所致的肺炎占住院儿童CAP的10%~40%^[1-2]。部分患儿可并发坏死型肺炎、肺不张、胸腔积液，或发生慢性肺间质性疾病、闭塞性细支气管炎等，严重影响患儿的健康及日后生活，需尽早明确诊断及治疗。但由于其临床征象及影像学不具备特征性^[3]，早期诊断存在困难。

MP培养一直被认为是诊断MP感染的“金标准”^[4]，但该方法操作复杂、培养周期长、且阳性率低，缺乏早期诊断价值。MP血清学抗体（MP-Ab）检测是临床最常用的诊断MP感染的方法，但由于MP感染后诱导体液免疫反应约1周后才产生抗体，容易出现假阴性的结果。国内MP核酸检测技术主要基于DNA靶标^[5]，不依赖于支原体是否存活，无法有效区分“死菌”和“活菌”，且检测时易引发实验室内交叉污染，出现假阳性的结果^[6]。实时荧光核酸恒温扩增检测技术（simultaneous amplification and testing, SAT）作为一种新型的分子生物学检测方法，针对病原体的靶标核酸设计特异的引物和分子信标，实现了特异性的扩增和检测，同时可以有效区分“死菌”和“活菌”，具有较高的敏感性和特异性^[7-8]。目前已成功应用于结核分枝杆菌、泌尿生殖道沙眼衣原体、肠道轮状病毒等病原的检测^[9-11]，最近开始应用于MP的检测，但相关的临床报道很少，而且主要集中在总体诊断价值的比较，对于早期诊断价值和影响MP-SAT检出因素的分析鲜有报道。本研究拟通过对在郑州大学附属儿童医院呼吸科住院的CAP患儿的咽拭子标本进行SAT检测，并对检测结果进行分析，从而评估SAT在儿童肺炎支原体肺炎（MPP）中的早期诊断价值及影响因素，为SAT在儿童MPP上的应用提供临床依据。

选取2016年12月至2017年12月在郑州大学附属儿童医院呼吸科住院的CAP患儿526例为研究对象，诊断标准参照《儿童社区获得性肺炎管理指南（2013年修订版）》^[12]。其中男351例，女175例；年龄2个月至9岁10个月，平均年龄2.8±2.6岁；入院病程2~23 d。排除入院时已行机械辅助通气，Glasgow评分 < 8分，合并先天性免疫缺陷、营养不良、病史资料不完整的患儿。本研究经医院伦理委员会批准通过，并征得家长的知情同意。

所有患儿均于入院24 h内行MP-SAT、MP-Ab（IgM+IgG）初测，初测MP-Ab阴性的患儿于病程10 d后（恢复期）进行复测，以MP-Ab检测作为MPP诊断的参照试验，评估MP-SAT在MPP早期诊断中的应用价值。MPP的诊断标准参照《儿童支原体肺炎诊治专家共识》：在CAP的基础上满足以下任意1项：（1）入院24 h内MP-Ab≥1 : 160；（2）急性期及恢复期双份血清抗体滴度呈4倍及以上升高^[13]。

MP-SAT检测：采用MP核酸检测试剂盒（上海仁度生物科技有限公司）进行检测。患儿入院当天由经过培训的专业人员采集咽拭子，并将其融于9 g/L盐水后加入等量裂解液制成待测样本。样本加入内标后，采用磁珠法提取靶标RNA，配置扩增检测液转至实时荧光定量PCR仪进行扩增，42℃ 1 min为1个循环，共40个循环，荧光通道为FAM（样本通道）和HEX（内标通道）。样本曲线与阈值曲线交叉点的横坐标读数（监测时间）为dt，dt≤35 min为阳性，dt > 40 min为阴性；35 < dt≤40 min的样本重新检测，dt≤35 min为阳性，dt > 35 min为阴性。

MP-Ab滴度测定：采用颗粒凝集法，应用SERODIA-MycoⅡ试剂盒（珠海丽珠试剂股份有限公司）检测IgM和IgG的混合抗体。所有患儿于入院时采集静脉血，初次检测阴性的患儿于入院10 d再次采集静脉血，分离血清待测。检测步骤按试剂盒说明书进行。MP-Ab滴度≥1 : 160判为阳性结果。

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析。定量资料采用均数±标准差（x±s）表示，定性资料采用率（%）表示，阳性率比较采用χ²检验。准确性检测采用约登指数（Youden index, YI），取值在0~1之间，YI越大，表明准确性越高；一致性分析采用Kappa检验，取值在0~1之间，Kappa≥0.75表明两者一致性较好；0.4 < Kappa≤0.75表明两者一致性一般；Kappa < 0.4表明两者一致性较差。多因素分析采用logistic回归分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

526例CAP患儿中，单份血清MP-Ab阳性112例，双份血清MP-Ab呈4倍及以上升高53例，共诊断MPP 165例。其中男106例，女59例；年龄3个月至9岁10个月，平均年龄3.5±3.4岁；入院病程2~15 d，平均病程4.5±4.2 d；合并病毒感染23例，合并细菌感染35例；难治性MPP 25例，重症MPP 11例；院外有大环内酯类药物治疗史32例；在发病季节方面，春季发病37例，夏季发病20例，秋季发病45例，冬季发病63例。

以MP-Ab结果为参照，MP-SAT检测结果阳性共158例，其中MPP 150例，非MPP 8例。MP-SAT诊断MPP的敏感度为90.9%（150/165）、特异度为97.9%（368/376）、阳性预测值为94.9%（150/158）、阴性预测值为98.1%（361/368）、阳性似然比为43.3、阴性似然比为0.09。诊断的准确性分析显示，YI为0.89，准确性高；一致性分析显示，Kappa值为0.90（P < 0.001），两者的一致性好。

根据入院时病程，将患儿分为短病程组（< 7 d）和长病程组（≥7 d），在短病程组中，MP-SAT阳性率为95%（93/98）；长病程组中MP-SAT阳性率为85%（57/67），MP-SAT在短病程组的诊断敏感度明显高于长病程组（χ²=4.646，P=0.031）。

在165例MPP患儿中，单份血清MP-Ab阳性112例，阳性率为67.9%（112/165），MP-SAT检测阳性150例，阳性率为79.4%（150/165），MP-SAT的诊断敏感度明显高于单份血清MP-Ab检测（χ²=5.635，P=0.018）。一致性分析显示，Kappa值为0.039（P < 0.001），两者的一致性差。

单份血清MP-Ab阴性的414例患儿于入院10 d后再次行血清MP-Ab检测，结果有53例患儿血清MP-Ab较入院时呈4倍及以上增高。414例患儿中，51例入院时MP-SAT检测结果阳性，其中MPP 48例；非MPP 3例。一致性分析显示，Kappa值为0.91（P < 0.001），两者的一致性好。

将可能影响MP-SAT诊断MPP的7个因素进行单因素分析。结果显示：性别（女）、年龄（≤3岁）、病程（≥7 d）、院外应用大环内酯类药物治疗、难治性MPP对MP-SAT诊断MPP的准确性产生影响（P < 0.05），而季节和是否为重症MPP对MP-SAT诊断MPP的准确性无影响（P > 0.05）。见表 1。

表 1 Table 1

表 1 MP-SAT在不同影响因素下的MPP检出情况

表 1 MP-SAT在不同影响因素下的MPP检出情况 因素 例数 (n=165) MP-SAT阳性率 [例(%)] χ2值 P值 性别   男 106 95(89.6) 5.256 0.022   女 59 45(76.3) 年龄   ≤3岁 61 51(83.6) 6.245 0.012    > 3岁 104 99(95.2) 季节   春季 37 33(89.2) 0.256 0.968   夏季 20 18(90.0)   秋季 45 41(91.1)   冬季 63 58(92.1) 病程    < 7 d 98 93(94.9) 4.646 0.031   ≥7 d 67 57(85.1) 院外应用大环内酯类药物治疗   是 32 25(78.1) 9.851 0.005   否 133 125(94.0) 难治性MPP   是 25 17(68.0) 6.506 0.011   否 140 123(87.9) 重症MPP   是 11 9(81.8) 1.179 0.278   否 154 141(91.6)

为了消除混杂因素的干扰，将单因素分析有意义的因素，进一步采用多因素logistic回归模型进行分析，结果显示病程（≥7 d）、应用大环内酯类药物治疗是影响MP-SAT检出结果的主要因素（P < 0.05）。见表 2。

表 2 Table 2

表 2 MPP患儿MP-SAT检出影响因素的logistic分析

表 2 MPP患儿MP-SAT检出影响因素的logistic分析 因素 B SE OR 95%CI P 病程(≥7 d) 1.875 0.699 5.667 2.256~7.854 0.041 院外应用大环内酯类药物治疗 2.289 0.586 7.752 3.125~12.487 0.022

MP-Ab检测是目前临床最常用的诊断MP感染的方法，单份血清MP-Ab滴度≥1 : 160对近期MP感染有诊断意义；恢复期和急性期MP抗体滴度呈4倍或4倍以上增高时可以确诊。但是由于MP感染后诱导体液免疫反应约1周后才产生抗体，3~6周可达高峰，2~3个月后逐渐下降^[14]，故难以达到早期诊断的目的。重症感染、婴幼儿患儿，由于免疫功能紊乱或免疫功能发育不完善，产生抗体的能力差，早期容易出现假阴性的结果^[15]。此外血清学检查属于有创操作，多次采集静脉血对于儿童尤其是低龄儿童来说存在一定的困难。故探索一种MP的早期诊断方法，有较重要的临床意义。

SAT作为一种新型的分子生物学检测方法，联合了PCR和荧光探针技术，以病原体特异的RNA为靶标，采用恒温扩增的方法，15~30 min即可将模板扩增109倍，MP-SAT检测最低可以准确地识别出10 CFU/mL的病原菌，具有极高的灵敏度^[8]。本研究中也显示MP-SAT在MPP的诊断中敏感度高达90.9%（150/165），且诊断的准确性高（YI=0.89），与血清MP-Ab抗体总体检测的一致性好（Kappa=0.90），提示MP-SAT在MPP的诊断中应用价值高。在本组资料中，入院时单份血清MP-Ab敏感度仅为67.9%，明显低于MP-SAT的敏感度（79.4%），两者的一致性差（Kappa=0.039），但是MP-SAT与双份血清MP-Ab的一致性好（Kappa=0.91）。这可能与部分患儿抗体产生较晚，或免疫功能发育不完善产生抗体能力较弱，从而导致单次MP-Ab检测不出有关。而MP-SAT检测的是病原体本身，不受自身免疫等相关因素的影响，可以有效弥补MP感染后因抗体产生延迟而导致的单份血清抗体检测假阴性的不足。本研究还发现MP-SAT在短病程组的诊断敏感度明显高于长病程组，进一步提示MP-SAT在MPP的早期诊断中具有较高应用价值。

本研究中，由经过专门培训的护士进行咽拭子采集，应用同一批次的试剂，排除标本采集和试剂选择这些因素干扰。通过查阅文献^[16-17]，把临床上可能影响MPP检出的相关因素进行分析，结果显示：院外大环内酯类药物的应用和长病程是影响检出率的主要因素。SAT技术检测的靶标是RNA，而RNA只存在活的菌体中，当病程较长时，由于自身免疫等因素可能会导致病原体活性下降，RNA裂解而不易检测。而经大环内酯类药物治疗的患儿，部分MP被清除，导致MP的载量降低，RNA减少，出现检测不出的情况。年龄、性别、是否为难治性或重症MPP等并不影响MPP的诊断，提示MP-SAT对于年龄小、病情危重、产生抗体慢或能力差的个体，可能具有更高的应用价值。

综上，MP-SAT在MPP的早期诊断中应用价值高，可以有效弥补急性期单份血清MP-Ab抗体检验的不足，辅助临床进行早期诊断；临床应用MP-SAT进行检测时，需注意病程长（≥7 d）和院外应用大环内酯类药物对检测结果的影响，尽量在病程早期或应用大环内酯类药物治疗前进行检测，必要时结合双份血清MP-Ab检测进行判断。