肺炎支原体肺炎（mycoplasmal pneumoniae pneumonia, MPP）是儿童常见的非典型肺炎，近年来发病率不断升高，临床症状多样，急性发作期若得不到及时治疗，可导致呼吸系统及其他多个系统严重损伤，甚至发生多器官功能障碍综合征^[1-2]。研究^[3]表明，MPP发病机制较为复杂，肺炎支原体导致的肺泡上皮细胞直接损伤或免疫炎症反应起着重要作用。NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3, NLRP3）作为机体固有免疫系统的重要感受器，在激发及调控炎症反应中发挥关键性作用^[4-5]。NLRP3与接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis associated speck-like protein, ASC）、半胱天冬酶1（caspase-1）结合后形成炎症小体，通过调控caspase-1活化，促进白细胞介素-1β（interleukin 1β, IL-1β）及IL-18等炎症因子成熟、释放，发挥促炎作用^[6]。本研究拟分析MPP患儿外周血NLRP3炎症小体通路表达变化，探讨其与MPP病情的相关性。

选取2014年3月至2017年12月益都中心医院治疗的MPP患儿147例为研究对象，其中男性86例、女性61例，年龄2~12岁，平均6.5±1.9岁。MPP诊断符合《诸福棠实用儿科学》相关标准^[7]。排除合并自身免疫性疾病、原发性免疫缺陷、恶性肿瘤、其他急慢性感染，以及近30 d使用过激素及免疫调节剂者。根据MPP患儿病情严重程度分为轻症组（83例）和重症组（64例）。重症MPP诊断^[8]需要符合以下至少1条：（1）大环内酯类抗生素治疗7 d仍有咳嗽、发热或者症状加重；（2）影像学检查示单侧或双侧大片状、高密度实变影，且有大量或中量胸腔积液，甚至弥散性肺间质浸润或坏死性肺炎表现；（3）出现严重的低氧血症或中枢神经系统症状、心肌炎、肾功能衰竭、消化道出血等。MPP急性期、恢复期判断根据《诸福棠实用儿科学》标准^[7]：（1）急性期：病程在10 d以内，白细胞总数和C反应蛋白轻度升高，血清MP-IgM抗体阳性，胸部影像学检查示双肺纹理粗、肺门影增大；（2）恢复期：咳嗽、咳痰以及肺部体征等消失或减轻，胸部影像学异常消失或减轻，体温正常2周以上。147例中急性期77例、恢复期70例。以本院体检中心健康体检儿童50例作为对照组，均排除免疫系统疾病，以及过敏性疾病、呼吸道急慢性感染，男性28例、女性22例，平均6.4±1.8岁，与MPP患儿在性别、年龄的差异无统计学意义（P > 0.05）。

本研究通过医院伦理委员会批准，以及研究对象知情同意。

MPP患儿于入院次日、对照组于体检当日抽取空腹静脉血10 mL分装于EDTA抗凝管和非抗凝管。抗凝管取血清，加入等体积PBS吹打、混匀，再加入等体积人淋巴细胞分离液（购自上海研谨生物科技公司），2 000 r/min离心15 min，留取单个核细胞层，加入5倍体积PBS洗涤后离心留取沉淀，保存于-80℃冰箱以备用。非抗凝血于3 500 r/min离心15 min，取上清，保存于-70℃冰箱。

取单个核细胞，加入细胞裂解液，按Trizol总RNA提取试剂盒（购自美国Invitrogen公司）说明提取总RNA，使用紫外分光光度计对总RNA纯度和浓度进行检测，以A260/A280在1.80~2.20为合格。按逆转录试剂盒（大连宝生物公司）说明将总RNA合成cDNA。使用实时荧光定量PCR仪（购自美国ABI公司），按照PCR扩增试剂盒（大连宝生物公司）说明进行扩增。引物序列：NLRP3上游：5'-TCTGTTCATTGGCTGCGGAT-3'，下游：5'-GCCTTTTTCGAACTTGCCGT-3'；ASC上游：5'-GCTGCAGATGGACCCCATAG-3'，下游：5'-ACATTGTGAGCTCCAAGCCA-3'；caspase-1上游：5'-CACGAGACCTGT GCGATCAT-3'，下游：5'-CTTGAGGGAACCACTCGGTC-3'；β-actin上游：5'-TGTCACCAACTGGGACGATA-3'，下游：5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3'。PCR反应条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s，连续循环38次，每个样品设3个平行复孔。使用2-△△Ct法计算外周血NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA相对表达量。

取血清，利用ELISA法检测IL-1β和IL-18水平。试剂盒均购自上海研域化学试剂公司。

使用SPSS 21.0软件进行数据处理。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间的比较采用两样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；相关性分析采用Pearson相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

MPP患儿外周血NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表达量，以及IL-1β和IL-18水平均高于对照组（P < 0.05），见表 1、2。

表 1 Table 1

表 1 肺炎支原体肺炎患儿和对照组的NLRP3、ASC和caspase-1表达比较  （x±s）

表 1 肺炎支原体肺炎患儿和对照组的NLRP3、ASC和caspase-1表达比较  （x±s） 组别 n NLRP3 mRNA ASC mRNA caspase-1 mRNA 对照组 50 1.16±0.10 1.04±0.08 1.08±0.05 MPP患儿 147 1.91±0.27 1.63±0.24 1.70±0.23 t值 19.091 17.093 18.497 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001

表 2 Table 2

表 2 MPP患儿和对照组的IL-1β和IL-18水平比较

表 2 MPP患儿和对照组的IL-1β和IL-18水平比较 （x±s, pg/mL） 组别 n IL-1β IL-18 对照组 50 2.7±1.1 107±14 MPP患儿 147 6.7±2.1 178±33 t值 13.142 14.656 P值 < 0.001 < 0.001

轻症、重症MPP患儿NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA表达量以及IL-1β、IL-18水平均高于对照组，以重症组更高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 3、4。

表 3 Table 3

表 3 不同严重程度MPP患儿NLRP3、ASC和caspase-1表达比较  （x±s）

表 3 不同严重程度MPP患儿NLRP3、ASC和caspase-1表达比较  （x±s） 组别 n NLRP3 mRNA ASC mRNA caspase-1 mRNA 对照组 50 1.16±0.10 1.04±0.08 1.08±0.05 轻症组 83 1.72±0.13a 1.45±0.10a 1.51±0.09a 重症组 64 2.17±0.18a, b 1.86±0.15a, b 1.94±0.12a, b F值 710.769 713.530 1193.426 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001 注：a示与对照组比较，P < 0.05；b示与轻症组比较，P < 0.05。

表 4 Table 4

表 4 不同严重程度MPP患儿IL-1β、IL-18水平比较

表 4 不同严重程度MPP患儿IL-1β、IL-18水平比较 （x±s, pg/mL） 组别 n IL-1β IL-18 对照组 50 2.7±1.1 107±14 轻症组 83 5.3±1.2a 154±15a 重症组 64 8.6±1.3a, b 209±23a, b F值 338.189 484.030 P值 < 0.001 < 0.001 注：a示与对照组比较，P < 0.05；b示与轻症组比较，P < 0.05。

MPP患儿急性期、恢复期的NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA表达量以及IL-1β、IL-18水平均高于对照组，以急性期更高，差异均有统计学意义（P < 0.05），见表 5、6。

表 5 Table 5

表 5 急性期、恢复期患儿的NLRP3、ASC和caspase-1表达比较  （x±s）

表 5 急性期、恢复期患儿的NLRP3、ASC和caspase-1表达比较  （x±s） 组别 n NLRP3 mRNA ASC mRNA caspase-1 mRNA 对照组 50 1.16±0.10 1.04±0.08 1.08±0.05 急性期 77 2.04±0.19a, b 1.79±0.17a, b 1.91±0.16a, b 恢复期 70 1.78±0.17a 1.51±0.12a 1.51±0.10a F值 453.903 451.097 762.161 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001 注：a示与对照组比较，P < 0.05；b示与恢复期比较，P < 0.05。

表 6 Table 6

表 6 急性期、恢复期患儿的IL-1β和IL-18水平比较

表 6 急性期、恢复期患儿的IL-1β和IL-18水平比较 （x±s, pg/mL） 组别 n IL-1β IL-18 对照组 50 2.7±1.1 107±14 急性期 77 7.9±1.8a, b 190±35a, b 恢复期 70 5.3±1.6a 163±33a F值 174.663 117.874 P值 < 0.001 < 0.001 注：a示与对照组比较，P < 0.05；b示与恢复期比较，P < 0.05。

Pearson相关分析显示，MPP患儿NLRP3 mRNA表达与ASC、caspase-1的mRNA表达以及IL-1β、IL-18水平均呈正相关（r=0.701、0.717、0.676和0.645，P < 0.05）。

MPP以肺间质和支气管急性炎症为主要病变，但也可能累及多个器官和系统，出现肺外并发症，严重者甚至危及患儿生命^[9-10]。有研究^[11]指出，快速、有效的评估MPP病情，对指导治疗改善患儿预后具有重要意义。目前，MPP致病机制尚未完全清楚，有研究指出，过度的免疫和炎症反应可能是MPP特别是难治性MPP发生的主要因素^[12]。固有免疫是机体抵御病原微生物入侵的第一道防线，模式识别受体作为固有免疫反应中代表性的免疫受体，识别入侵机体的病原微生物并相互作用而活化下游信号通路，引发机体免疫应答和炎症反应^[13]。NOD样受体是细胞内主要的模式识别受体，NLRP3则是主要的NOD样受体类型，活化后可与ASC及caspase-1组成NLRP3炎症小体，在炎症反应中发挥核心作用^[14]。有研究^[15]指出，NLRP3炎症小体在肺结核、哮喘、慢性阻塞性肺疾病等发病机制中发挥重要作用。本研究显示，MPP患儿外周血NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA表达量均高于对照组，提示NLRP3炎症小体可能参与了MPP发病过程。

机体中NLRP3炎症小体一旦受到病原微生物或内源性危险信号激活，则促进下游IL-1β和IL-18等促炎因子大量成熟并分泌到细胞外，进而使IL-1α、IL-6、TNF-α等炎症因子活化而导致机体过度炎症反应^[16]。本研究还显示，MPP患儿IL-1β和IL-18水平也高于对照组，且NLRP3 mRNA表达与ASC、caspase-1的mRNA表达以及IL-1β、IL-18水平均呈正相关，进一步说明NLRP3炎症小体介导的炎症反应可能参与MPP发病。而且本研究重症或者急性期患儿NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA表达量及IL-1β和IL-18水平高于轻症组和恢复期患儿，提示NLRP3炎症小体可能与MPP患儿病情严重程度以及病程有关，有望成为评估MPP患儿病情和疾病进程的指标。

综上所述，MPP患儿NLRP3炎症小体通路的表达发生改变，与病情严重程度及病程进展有关，有望成为评估MPP患儿病情及病程的辅助指标。