2018, Vol. 20
进行性家族性肝内胆汁淤积症2型（progressive familial intrahepatic cholestasis type Ⅱ, PFIC-2）是由ABCB11基因突变引起的遗传性胆汁淤积症，曾被称为Byler综合征[1-2]。ABCB11基因位于染色体2q24，共有28个外显子，除1号外显子外，其余外显子均参与编码位于肝细胞毛细胆管膜上的胆盐输出泵（bile salt export pump, BSEP）。BSEP蛋白由1 321个氨基酸组成，分子量约160 kDa，其功能是可作为三磷酸腺苷（ATP）依赖性胆汁酸转运体，通过水解ATP逆浓度梯度转运胆盐至毛细胆管内[3-4]。作为肝脏唯一具有胆盐转运功能的蛋白，BSEP蛋白表达水平和/或功能异常可严重影响胆盐分泌，引起肝内胆汁淤积[3]。PFIC-2患儿最突出的生化特点为γ-谷氨酰转肽酶（GGT）活性正常或偏低[1]，这有别于一般的肝内胆汁淤积症。本病主要临床表现为黄疸、皮肤瘙痒、肝脾大、发育迟缓，病情往往进展迅速，几年之内可发展为终末期肝病；部分患者在婴儿期就需要肝移植，未接受肝移植的患者可能出现肝癌或胆管癌[5-7]。
目前已报道的与PFIC-2相关的ABCB11致病性变异约有150种，包括错义、缺失、插入、移码和无义变异等[8]。近年来国内该病相关的报道主要来自上海、北京、广州、武汉等中心城市的大型医院[9-12]。因此，PFIC-2诊治经验还需要大力推广普及，其临床和实验室特征也需要进一步研究总结。本文报道1例PFIC-2患儿的临床和遗传学特征，希望为PFIC-2的诊治进一步积累经验。
1 资料与方法 1.1 研究对象患儿，男，2.4月龄，因发现皮肤巩膜黄染2月余就诊。患儿生后第2天即出现皮肤、巩膜黄染，一直未消退。在当地医院查肝功能异常，予护肝等相关处理（具体不详），黄疸逐渐加重，并出现白陶土样大便及茶色尿。1.9月龄时于小儿外科就诊，体格检查发现除全身皮肤、巩膜黄染外，肝脏右肋下5 cm、质地中等，脾脏不大；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）、结合胆红素（DBIL）、总胆汁酸（TBA）均明显升高，但GGT不高，以“梗阻性黄疸”收入院。住院期间血串联质谱筛查发现游离肉碱显著增高，尿串联质谱及凝血功能无异常。磁共振胰胆管造影（MRCP）+上腹部MRI+呼吸门控检查未见明显器质性病变。住院后予积极抗炎、护肝、利胆治疗半个月，期间多次复查肝功能均无好转（见表 1）。为进一步明确诊断，转我院就诊。起病以来，精神反应一般，吃奶尚可。患儿系第2胎第2产，足月顺产出生，出生体重为3 650 g，身长51 cm。父母非近亲结婚，否认遗传性疾病家族史。其母孕期有皮肤瘙痒病史。祖母曾患胆结石。
| 表 1 患儿历次生化检查结果 |
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体格检查:神清，反应可。皮肤、巩膜黄染，浅表淋巴结无肿大。头颅五官无畸形，前囟平软。双侧瞳孔等大等圆，对光反射灵敏。双肺呼吸音清，未闻及干湿啰音。心音有力，律齐，各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音。腹不胀，肝右肋下3.0 cm、质地中等，脾不大。四肢肌张力正常，腹壁和膝腱反射可引出，克氏、布氏和巴氏征均阴性。
1.2 代谢性肝病组基因二代测序患儿生后第二天起病，肝功能提示梗阻性黄疸，但GGT基本正常，因此需要考虑遗传性胆汁淤积症，通过二代测序（NGS）技术查代谢性肝病组基因，以明确病因。
采集患儿外周静脉血2 mL（EDTA抗凝），用Mini kit试剂盒（Simgen公司，中国）提取基因组DNA，建立含有与代谢性肝病（包括胆汁淤积症）相关基因（ACADVL、B4GALT1、C10orf2、DBT、EARS2、FADD、SLC25A13、VIPAS39及VPS33B等共233个基因）的基因组文库。用液相捕获试剂盒（迈基诺公司，中国）捕获上述目标基因，采用新一代测序仪IlluminaHiSeq2000（Illumina公司，美国）进行高通量测序。测序平均深度不小于200。根据文献[13]，将测序数据进行基因序列生物信息学分析。
1.3 Sanger测序验证突变提取患儿及其父母的外周血DNA，根据二代测序的检测结果，采用Sanger测序验证ABCB11突变基因。根据ABCB11基因的DNA序列，使用Primer Premier 5.0软件设计聚合酶链反应引物（如表 2，北京迈基诺基因科技股份有限公司合成）。聚合酶链反应体系:2×Goldstar Buffer Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 1 μL，灭菌双蒸水7 μL，共20 μL。反应条件参照文献[13]:95℃预变性10 min；随后分为4步，即第1步94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸45 s，共3个循环；第2步94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共5个循环；第3步94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共10个循环；第4步94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共17个循环；最后再72℃延伸5 min。
| 表 2 Sanger测序验证ABCB11基因突变位点所在DNA序列的扩增和测序引物 |
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通过Ensembl Genome Browser（http://www.ensembl.org）中人ABCB11基因的直系同源列表收集112个同源肽的氨基酸序列，然后使用BLAST / BLAT Ensembl软件（http:/ //www.ensembl.org/Multi/Tools/Blast?db=core）进行比对。
采用MutationTaster（http://www.mutationtaster.org/）、PROVEAN（http://provean.jcvi.org/seq_submit.php）、PolyPhen 2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、SIFT（http://sift.jcvi.org/www/SIFT_chr_coords_submit.html）等在线软件工具，预测变异的致病性。
为评估由ABCB11基因新型变异p.Val501Gly引起的蛋白质结构变化，使用SWISS-MODEL蛋白质建模服务器（https://swissmodel.expasy.org/）构建受影响的蛋白分子。将p.Val501野生型模型的第501位氨基酸由Val变成Gly进行模型能量最小化，并比对两者构象差异[13]。
本研究通过暨南大学附属第一医院医学伦理委员会批准，并获得患儿父母知情同意。
2 结果 2.1 遗传学分析NGS检测发现患儿ABCB11基因存在两个错义变异，分别为c.1493T > C（p.Ile498Thr）和c.1502T > G（p.Val501Gly），均位于该基因的外显子14（图 1）。前者为文献[14]报道的致病性变异。
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图 1 患儿外显子捕获测序截图 ABCB11基因互补链c.1502位点的腺嘌呤A部分突变为胞嘧啶C，c.1493位点的腺嘌呤A部分突变为鸟嘌呤G。 |
进一步通过Sanger测序验证，确认患儿以上变异，并证实两个变异分别来自其父母，见图 2。
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图 2 患儿及其父母ABCB11基因突变的Sanger测序 患儿系c.1502T > G和c.1493T > C的复合杂合子，其父为c.1493T > C突变携带者，其母为c.1502T > G突变携带者。突变位点如箭头所示。 |
在千人基因组计划（http://browser.1000genomes.org）、人类基因突变数据库（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）、外显子组测序项目（https://esp.gs.washington.edu/drupal/）中均未检索到c.1502T > G（p.Val501Gly）变异，查阅中国知网、PubMed等文献数据库，也未见该变异的文献报道。
c.1502T > G（p.Val501Gly）的MutationTaster软件预测得分109，提示具有致病性；PROVEN预测得分-6.036，提示该变异有害；PolyPhen-2预测得分为1.000，提示可能有害；而SIFT软件预测得分为0，提示变异对蛋白质的功能有影响。
c.1502T > G变异累及的p.Val501氨基酸残基在从低等单细胞生物到灵长类动物的112个物种的BSEP同源肽中高度保守。图 3显示39种代表性物种同源肽氨基酸序列的比较排序结果，可见人类BSEP蛋白同源肽的相应位点氨基酸均为缬氨酸。采用SWISS-Pdb Viewer 4.1.0软件预测发现，该变异使得第501位氨基酸由缬氨酸变成甘氨酸，使其附近氨基酸之间的氢键距离改变，同时伴有新的氢键生成，见图 4。
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图 3 39个代表性物种BSEP蛋白同源肽比较排序 ABCB11基因变异c.1502T > G累及的p.Val501氨基酸残基（红色标记的V）从低等单细胞生物到灵长类动物均高度保守。 |
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图 4 p.Val501Gly突变前后BSEP蛋白空间结构预测图 图A为野生型BSEP蛋白结构模型，图B为突变后蛋白结构模型。第501位氨基酸由缬氨酸（A）变为甘氨酸（B），附近氨基酸之间的氢键距离发生改变（虚线表示氢键，白色数字为氢键距离），同时伴有新的氢键生成（图B黄色箭头所示为新生氢键，分别在p.ILE500和p.ILE569以及p.ILE500和p.LEU581之间生成）。 |
本研究患儿经NGS及Sanger测序验证，最终确诊为ABCB11基因突变导致的PFIC-2。予熊去氧胆酸口服治疗，并随访至3.8月龄，患儿黄疸和肝肿大等临床表现无改善，转氨酶、胆红素和胆汁酸等仍显著异常，但GGT基本正常（表 1）。3.8月龄以后失访，结局不明。
3 讨论进行性家族性肝内胆汁淤积症（PFIC）是一组以肝内胆汁淤积为主要表现的遗传性疾病。根据致病基因不同，可将PFIC分为PFIC1、PFIC2和PFIC3等类型，分别由ATP8B1、ABCB11和ABCB4等基因突变引起。PFIC1、PFIC2和PFIC3皆可表现为黄疸和瘙痒，但前两者GGT基本正常，PFIC2进展较PFIC1剧烈、但无PFIC1的肝外症状；PFIC3瘙痒症状较轻，但GGT水平持续增高，可与其它两型区分。近年来，越来越多的PFIC类型被发现，此类疾病的确诊不能仅仅依靠临床表现和血生化结果，基因诊断被认为是确诊此类疾病的最可靠依据[1, 15-17]。
本研究患儿胆汁淤积症表现典型，但GGT基本正常，不符合胆道闭锁特点而高度提示遗传性肝病。有类似临床特征的遗传胆汁淤积症病因复杂，已报道的致病基因多达数百个，因此通过NGS查找病因。结果发现患儿为ABCB11基因c.1493T > C（p.Ile498Thr）和c.1502T > G（p.Val501Gly）的复合杂合子，分别来自父母。前者为已报道的致病变异[14]；后者未见文献报道，但多种生物信息学软件分析均提示该变异具有致病性。有研究表明，ABCB11错义变异的携带者临床表现可为良性复发性的肝内胆汁淤积2型（BRIC-2），怀孕为胆汁淤积的诱发因素[18]。值得注意的是，患儿母亲携带新变异c.1502T > G（p.Val501Gly），孕期有皮肤瘙痒病史（孕期生化检查结果缺如），也提示新变异具有致病性可能。有文献报道，游离肉碱水平增高可见于肉碱棕榈酰转移酶-1缺乏症、继发于肝功能损伤、也可继发于口服或静滴左卡尼丁等情况[19]。本例患儿的血串联质谱筛查游离肉碱显著增高，考虑继发于PFIC-2引起的肝功能损伤。
BSEP蛋白由2个跨膜结构域和2个核苷酸结合折叠区组成，每一个跨膜结构域含6个跨膜区，而每一个核苷酸结合折叠区均包含1个高度保守的ATP结合盒（ABC），其中第一个ATP结合盒位于p.Asp482与p.Arg575之间。本例患儿检出的ABCB11新变异c.1502T > G（p.Val501Gly）累及的氨基酸残基就位于第一个ATP结合盒附近，可能影响BSEP蛋白与ATP结合，导致胆汁酸的转运异常，从而导致黄疸和肝大等肝内胆汁淤积表现[20]。生物信息学分析也表明，p.Val501Gly突变可以扭曲BSEP蛋白分子结构影响其胆盐转运功能。BSEP蛋白在内质网合成和折叠，糖基化后被转运至肝细胞胆管膜发挥转运胆盐的功能。据报道，错义变异p.Glu297Gly和p.Asp482Gly均可导致BSEP的错误折叠而滞留在内质网，而滞留在内质网的BSEP蛋白由于不稳定被降解，导致肝细胞胆管膜上的BSEP蛋白减少[21-22]。本文发现的新错义变异也可能通过类似机制导致BSEP蛋白不能正常到达肝细胞胆管膜并发挥功能。
PFIC-2的内科治疗主要包括熊去氧胆酸和利福平。低GGT水平的PFIC患者约有35%~40%对熊去氧胆酸有效。利福平可缓解某些患者的瘙痒症状，但对降低PFIC-2患者血清胆红素和转氨酶升高无长期作用[23-24]。其他药物，如苯扎贝特和S-腺苷蛋氨酸的疗效尚待进一步验证[25]。一些PFIC-2患者可从外科胆汁分流术获益[4]。对于上述治疗失败进展到终末期肝病的PFIC-2患者，可考虑肝移植。肝移植可有效缓解黄疸等胆汁淤积症状，改善患儿的生长发育迟缓[26]。个别PFIC-2患者肝移植后复发，并检测到抗BSEP的自身抗体，这种情况在严重的ABCB11突变中容易出现[27]。PFIC-2患儿有相当大的风险进展为肝肿瘤，因此建议婴儿期早期确诊和临床干预[28]。遗憾的是，本研究患儿确诊后失访，无法得知其结局。
综上所述，本文报道1例PFIC-2患儿，具有典型的黄疸、肝大和肝功异常等胆汁淤积症特征，而GGT正常。新变异c.1502T > G（p.Val501Gly）的发现为确诊和家系遗传咨询提供了遗传学依据。
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