炎症性肠病（inflammatory bowl disease, IBD）是一种反复发作的以肠道黏膜破坏为主的消化道非特异性免疫性疾病，病因复杂、疗效欠佳，严重影响患儿的生活质量^[1]。虽然近年来，国内外专家认为专一肠内营养在儿童轻中度IBD中有诱导活动期缓解的作用，但维持缓解及促进黏膜愈合的作用尚不明确^[2]。Fujita等^[3]研究认为添加谷氨酰胺（Gln）强化肠内营养对溃疡性结肠炎动物模型的肠道黏膜修复可能具有一定的作用。因此，探讨添加Gln强化肠内营养是否能促进IBD患儿肠黏膜愈合更具临床意义。由于肠道炎症的发生与肠道黏膜细胞过度凋亡密切相关，目前，公认影响肠道黏膜凋亡的基因有bcl-2、bax，凋亡信号转导因子有Caspase-3、9等，且众多研究表明，胰岛素样生长因子-1（IGF-1）与胃肠黏膜细胞酪氨酸激酶受体结合，能促进肠黏膜细胞生长和增殖，保护肠黏膜的屏障功能^[4]。故本研究拟通过探讨上述凋亡基因、凋亡信号转导因子及IGF-1在各组间的表达变化，进一步明确Gln强化肠内营养对IBD幼鼠模型影响的作用机制。

短肽制剂（纽迪希亚公司，荷兰），谷氨酰胺（Gln）颗粒（海南海神通州制药有限公司），三硝基苯磺酸（TNBS）（广州蓝光生物技术有限公司），BRU抗体、SABC（小鼠）试剂盒及DAB显色试剂盒（黄）（广州威佳科技有限公司），尿粪隐血测试盒（联苯胺法）及Anti-IGF-1抗体51088（广州安邦生物科技有限公司），TRIzol（广州恩轲肽医药科技有限公司），PCR引物序列（上海生工生物工程技术服务有限公司）。

80只4~5周龄Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，体重50~100 g，购自广东省医学实验动物中心。依照随机数字表法随机分为空白对照组、IBD模型组、短肽组、短肽+Gln组，每组20只。IBD模型制备参照文献^[5]，大鼠禁食24 h后按100 mg/kg一次性结肠灌注TNBS乙醇（50%）溶液0.5 mL。24 h后小鼠即可能出现厌食、少动、腹泻、黏液血便等症状，2~3 d后出现急性结肠炎病理改变。病理显示病变部位以结肠为主，可累及小肠，肉眼见肠腔扩张，与周围黏连，黏膜水肿、溃疡，有点状和片状出血；镜下可见溃疡和炎性渗出物，炎症累及肠壁全层，伴肉芽肿形成，病理改变与人类克罗恩病相似。空白对照组给予同剂量生理盐水灌肠。造模后3 d开始，短肽组每日分两次给予短肽制剂（100 mL/kg），干预1周；短肽+Gln组每日分两次给予短肽（100 mL/kg）+Gln（0.5 g/kg）混合液，干预1周。每天记录饮食、体重、大便情况及毛色。7 d后依次将大鼠处死后留取结肠、小肠组织标本，肉眼观察结肠黏膜的大体情况，即结构是否完整、黏膜表面有无异常物质。并取结肠远、中、近不同节段的组织进行固定、切片、苏木素-伊红（HE）染色。

每组取10只大鼠结肠黏膜组织进行RT-PCR检测。按照TRIzol法对收集的组织样本进行总RNA的提取。紫外分光光度计法检测总RNA样本的纯度和浓度。按照Takara反转录试剂盒方法将总RNA中的mRNA反转录成cDNA。cDNA样本按10倍稀释后作为荧光定量PCR的模板。bcl-2上游引物：5'-CCACCTGTGGTCCATCTGAC-3'，下游引物：5'-GGTGCAGCTGACTGGACATC-3'，片段长度：94 bp；Bax上游引物：5'-GGAGATGAACTGGACAG-CAATATGG-3'，下游引物：5'-TAGCAAAGTAGAAG-AGGGCAACCA-3'，片段长度：154 bp；Caspase-3上游引物：5'-GGTGGAGGCTGACTTCCTGT-3', 下游引物：5'-GCGCGTACAGCTTCAGCAT-3'，片段长度：119 bp；Caspase-9上游引物：5'-ATTCAGCAGG-CAGGATCTGG-3'，下游引物：5'-TGGCCTGTGTCC-TCTAAGCA-3'，片段长度：119 bp。冰上配制10 μL反应体系：2×PowerUp SYBR Green 5 μL，上下游引物各0.3 μL，Template cDNA 2 μL，ddH₂O 2.4 μL。PCR反应条件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 40 s，共35个循环；72℃ 5 min，16℃ hold；最后10℃延伸10 min。采用2^-△△CT法分析目的基因的相对表达水平。

每组取10只大鼠结肠黏膜组织进行Western blot检测。取冻存的新鲜肠黏膜组织200 mg，在液氮预冷的研钵中研碎，加入组织细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上放置20 min，13 000 r/min低温下离心15 min，取上清。用Bradford法进行蛋白定量后分装，放入-80℃冰箱保存。采用免疫印迹法测定总蛋白中IGF-1含量，首先SDs-PAGE进行蛋白分离，再低温下（4℃）转移到PDVF膜上进行免疫杂交，用50 g/L牛奶封闭液封闭非特异性抗原位点，PBST清洗后，滴加兔抗鼠IGF-1多克隆抗体（稀释比1 : 500，北京四正柏生物科技有限公司）一抗溶液4℃孵育过夜，然后加入山羊抗兔IgG H & L（HRP）（稀释比1 : 5 000，英国Abcam公司）二抗溶液孵育1~2 h，用ECL化学发光法显色并测定分析。经Alphalmager 2200分析软件分析，计算出IGF-1的相对表达水平，结果以IGF-1/GADPH灰度比值表示。

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

模型组于第3天和第4天死亡3只，其余组幼鼠模型均成活。空白对照组进食量平均每天114 g，总体重平均增长96.8 g，大便质硬，毛发有光泽，肠段有弹性，肠黏膜光滑。IBD模型组平均每天进食36 g，平均体重增长18.2 g，持续黏液血便，毛发无光泽，肠段易断裂，肠黏膜有破损。短肽组平均每天进食66 g，平均体重增长30.4 g，4~5 d半稀便，6~7 d逐渐成形，毛发部分无光泽，肠黏膜有破损、质脆；短肽+Gln组平均每天进食72 g，平均体重增长37.7 g，3 d后大便为成形软便，毛发大部分有光泽，肠黏膜出现较多透明无内含物的片段，肉眼观察其壁较薄。

空白对照组结肠黏膜细胞完整；IBD模型组可见炎性细胞浸润，腺体破坏；短肽组可见炎性细胞浸润，腺体散在破坏；短肽+Gln组结肠黏膜表面可见透明物质，散在炎性细胞浸润，腺体少许破坏，毛细血管增生。见图 1。

图 1 不同组别干预1周后肠黏膜组织病理学改变 A：空白对照组结肠黏膜细胞完整；B：IBD模型组炎性细胞浸润，腺体破坏；C：短肽组炎性细胞浸润，腺体散在破坏；D：短肽+Gln组散在炎性细胞浸润，腺体少许破坏，毛细血管增生。

凋亡调控基因bax mRNA在IBD模型组表达水平高于空白对照组、短肽组和短肽+Gln组（P < 0.05）。另一凋亡调控基因bcl-2及信号转导因子Caspase-9、Caspase-3 mRNA在IBD模型组高水平表达，而在短肽组及短肽+Gln组表达稍低，但差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。

表 1 Table 1

表 1 不同组别结肠凋亡调控基因及信号转导因子表达的比较（x±s）

表 1 不同组别结肠凋亡调控基因及信号转导因子表达的比较（x±s） 组别 n bax mRNA Caspase-3 mRNA bcl-2 mRNA Caspase-9 mRNA 空白对照组 10 1.02±0.23 1.01±0.15 1.15±0.31 1.02±0.23 IBD模型组 10 1.65±0.19a 1.21±0.61 1.89±0.12 1.23±0.28 短肽组 10 0.82±0.28b 0.71±0.39 1.36±0.53 0.66±0.36 短肽+Gln组 10 0.56±0.16b 0.76±0.27 0.94±0.61 0.96±0.23 F值 4.649 1.909 0.220 1.894 P值 0.015 0.166 0.882 0.169 注：a示与空白对照组比较，P < 0.05；b示与IBD模型组比较，P < 0.05。

用Western blot方法检测各组结肠黏膜IGF-1相对表达水平，其中IBD模型组为1.1±0.6，空白对照组为1.2±0.6，短肽+Gln组为1.3±0.6，短肽组为2.1±0.4。各组IGF-1相对表达水平比较差异有统计学意义（F=5.130，P=0.014），其中短肽组明显高于短肽+Gln组、空白对照组及IBD模型组（P < 0.05）。见图 2。

图 2 Western blot法检测各组结肠黏膜IGF-1表达 1：IBD模型组；2：空白对照组；3：短肽+Gln组；4：短肽组。

动物实验研究的基本保障是获得满意模型，本研究通过预实验获得了造模经验，大大提高了动物模型成功率。尽管IBD动物模型的研究已近1个多世纪的历史，但目前仍未得到十分理想的IBD动物模型，不同的制作方法、不同的动物可制作出不同的动物模型，这本身也说明了IBD病因的多样性和发病机制的复杂性。有学者认为化学药物如TNBS诱导的IBD动物模型制作相对简单、成本低，在IBD的实验研究中应用最广泛，且由TNBS诱导的结肠炎动物模型主要是Th1细胞介导的反应，与人类克罗恩病十分相似^[6]，故本研究选择了此方法进行造模。但对于幼鼠造模的难度相对较大，容易死亡，精确计算好药物剂量，选择合适的灌肠管径，操作轻柔是保证造模成功，减少幼鼠死亡的关键步骤。因此，建议动物模型的建立必须进行预实验探索研究对象的特性才能保证理想模型的获得。

营养状态的改善是IBD疗效评价的重要指标之一。Akobeng等^[7]认为肠内营养治疗对儿童IBD的安全性及有效性尚存争议。本组实验通过Gln强化肠内营养干预IBD幼鼠模型，与其他组进行比较，结果发现Gln干预组幼鼠毛发光泽度好，体重增长较快，解剖后观察肠道黏膜溃疡面表浅，表面有透明物质覆盖，明显改善了该组幼鼠的营养状态，本组中无1例幼鼠模型死亡，说明该方案安全可靠。因此，可认为Gln强化肠内营养在IBD治疗中能有效改善营养状态及体重数据，且安全可靠，与Fujita等^[3]报道一致。

诱导炎症活动期缓解是IBD患儿治疗的初级目标，本研究通过Gln强化肠内营养对凋亡调控基因及相关因子表达的影响，减轻了肠道的炎症反应，达到了诱导缓解的目的。IBD炎症活动期常常表现为肠黏膜细胞的凋亡过度，Bcl-2和Bax是公认的凋亡调控基因，Caspase-9、Caspase-3是凋亡信号转导因子^[8]。本研究通过Gln强化肠内营养对肠道黏膜凋亡调控基因及信号转导因子的影响来观察活动期炎症的控制效果从而诱导缓解。通过1周干预后，IBD模型组细胞凋亡调控基因和信号转导因子表达水平显著高于其他模型组，提示IBD模型组肠道黏膜细胞凋亡活动活跃，仍处于炎症活动期；而Gln+短肽组bax的表达量明显低于短肽组、IBD模型组及空白对照组，提示凋亡受抑，在Caspase-9、Caspase-3的表达也存在一定差异，提示Gln强化的肠内营养在抑制肠道细胞凋亡诱导炎症活动期缓解有显著作用。与崔培林等^[9]报道的Gln在急性重症胰腺炎导致的肠黏膜受损患者中能有效抑制肠黏膜细胞的凋亡作用机制相似。

黏膜愈合是IBD治疗的终极目标。本研究发现，单一肠内营养和Gln强化肠内营养都能通过上调IGF-1而达到促进肠道黏膜愈合的目的。IGF-1属于胰岛素样生长因子家族^[10]，众多研究表明，IGF-1与胃肠黏膜细胞酪氨酸激酶受体结合，促进肠黏膜细胞生长和增殖，维护肠绒毛的高度及肠神经的发育，保护肠黏膜的屏障功能^[4]。曾有学者认为Gln能有效促进肠道黏膜的修复，尤其是对缺血性肠黏膜损伤修复作用显著^[11]，另有学者通过急性胰腺炎动物模型实验证实Gln是通过上调IGF-1高表达而达到修复损伤黏膜及维护肠道屏障功能^[8]。本组研究显示IGF-1在短肽组及短肽+

Gln组的表达水平均高于其他组，通过大体标本观察肠黏膜的修复显著好于对照组，提示单一肠内营养及短肽+ Gln强化的肠内营养制剂都能显著上调IGF-1的表达发挥肠黏膜修复及屏障功能维护的作用，与前两位学者的结论一致。

综上所述，Gln强化肠内营养对IBD幼鼠模型有促进体重增长及维持营养状态的积极作用，对肠道黏膜细胞凋亡的抑制及上调IGF-1高表达方面也表现出了较强优势。故认为Gln强化肠内营养在IBD的治疗中是安全有效的，而且在诱导急性期缓解及促进肠道黏膜愈合方面更具优势。