2019, Vol. 21
2. 新疆维吾尔自治区人民医院科研教育中心, 新疆 乌鲁木齐 830001;
3. 新疆维吾尔自治区胸科医院儿科, 新疆 乌鲁木齐 830049
结核病仍是全球性最关注的公共卫生问题之一，WHO最新报告显示：2017年全球新发结核病患者约1 000万，结核病发病率为133/10万，其中小于15岁的新发儿童患者约101万，占到新发患者的10%[1]。本课题组前期研究发现，成人肺结核患者外周血中Th2细胞比例显著升高，Th1细胞比例变化不明显，存在Th1/Th2失衡，Notch信号通路与Th1/Th2失衡相关，阻断T细胞Notch信号途径后会逆转这种失衡[2-4]，但在儿童结核病的研究中尚未见文献报道。Notch是高度保守的信号途径，在哺乳动物中有4个受体Notch1~4，5个配体Delta-like（DLL）1、3、4和Jagged（JAG）1、2，以及两类下游靶基因Hes和Hey家族，参与调控细胞分化、增殖和凋亡[5-6]。由于儿童的机体免疫系统尚未发育完善，与成人免疫存在一定差异，因此本研究拟采用实时荧光定量PCR法检测结核病患儿白细胞中Notch信号途径相关分子的mRNA水平，初步探讨Notch信号途径在儿童结核病中的作用。
1 资料与方法 1.1 研究对象选取2017年6月至2018年12月在新疆维吾尔自治区胸科医院儿科就诊并住院的结核病患儿62例为病例组，其中男38例，女24例，平均年龄7.8±4.5岁，结核病诊断标准参见《中华人民共和国卫生行业标准肺结核诊断》（WS 288-2017）[7]。另选取同期于新疆维吾尔自治区人民医院进行健康体检的64例儿童为健康对照组，其中男28例，女36例，平均年龄8.6±3.7岁，健康对照组儿童均有卡介苗接种史，无结核病接触史，无结核病相关临床表现及影像学表现，且年龄、性别与病例组患儿匹配，差异无统计学意义。
1.2 样本采集及处理静脉采集病例组及健康对照组儿童外周血2 mL，应用溶血素进行红细胞裂解，留取白细胞，-80℃保存待检。
1.3 Notch信号途径相关分子mRNA水平检测应用实时荧光定量PCR法检测受体Notch1~4，配体DLL1、3、4和JAG1、2，以及下游靶基因Hes1和Hey1的mRNA水平。试剂盒采用QuantiFast SYBR Green PCR Kit（德国Qiagen公司）。GenBank中检索目的基因和内参基因GAPDH cDNA序列，应用DNA MAN软件设计引物（表 1），引物由上海生工生物股份有限公司合成。反应体系（20 μL）：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL（5 μmol/L），ddH2O 8 μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃ 10 s，60℃30 s，40个循环，并绘制熔解曲线。记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即Ct值，结果以2-ΔΔCt法对目的基因进行定量。
| 表 1 引物序列 |
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采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学分析。符合正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；不符合正态分布计量资料采用中位数（四分位间距）[M（P25，P75）]表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料采用构成比（%）表示，两组间比较采用卡方检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 结核患儿临床资料62例确诊的结核病患儿，均为初治患者且无其他合并症，均未接受过抗痨治疗。其中原发性肺结核12例，继发性肺结核16例，气管/支气管结核5例，血行播散性肺结核9例，结核性胸膜炎13例，结核性脑膜炎7例；结核菌素试验阳性45例，阴性17例；结核感染T细胞检测结果阳性37例，阴性25例；卡介苗接种48例，未接种9例，不祥5例；与结核病患者接触51例，未接触7例，不祥4例；抗酸染色痰涂片结果阳性9例，阴性40例，未做13例。
2.2 两组外周血中Notch1~4 mRNA表达水平与健康对照组比较，病例组患儿Notch1 mRNA和Notch2 mRNA表达水平明显升高（P < 0.05），两组Notch3 mRNA和Notch4 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见表 2。
| 表 2 两组儿童Notch1~4 mRNA水平比较 [M（P25，P75）] |
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与健康对照组比较，病例组DLL4 mRNA表达水平明显升高（P < 0.05），其他JAG mRNA和DLL mRNA表达水平在两组间比较差异无统计学意义（P > 0.05），见表 3。
| 表 3 两组儿童JAG mRNA和DLL mRNA水平比较 [M（P25，P75）] |
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与对照组比较，病例组Hes1 mRNA和Hey1 mRNA表达水平无明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05），见表 4。
| 表 4 两组儿童Hes1 mRNA和Hey1 mRNA水平比较 |
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Notch信号途径参与急性淋巴细胞白血病[8]，成骨、破骨细胞和血管生成[9]，细胞命运与器官形态发生[10]等。但是不同的疾病中，Notch信号途径相关受体、配体和靶基因表达有差异，国外有学者报道，牛分枝杆菌感染的小鼠模型中，Notch1、Notch3、JAG1、DLL-1、DLL-3和Hes1表达上调[11]，本课题组前期研究发现，成人肺结核病外周血中Notch1~4、JAG2和Hes1表达上调[12]，尤其Notch1表达上调与Th2细胞比例升高密切相关[13-14]。小鼠模型中，小肠切除（SBR）导致隐窝上皮细胞增殖，JAG-1、Hes-1 mRNA和蛋白的表达及NICD1增加[15]。本研究结果发现Notch1、2和DLL4在儿童结核病中表达明显升高，而其他受体、配体和下游靶基因表达无明显变化，与前期研究[11-12, 15]结果不一致，可能与结核病患儿机体免疫系统发育不完善有关，此研究结果提示儿童感染结核菌后Notch1、2活化与其配体DLL4相互作用启动Notch信号途径，但如何发挥作用呢？有研究表明，Notch信号途径活化后不止作用其相关通路上的靶基因Hey和Hes家族，还可以作用于其他基因（如：GATA3）协同调控CD4+ T向Th1/Th2类型分化或2型固有淋巴细胞（ILC2）发育，Notch信号的强弱决定了人类祖细胞的分化方向，弱的Notch信号促使T细胞发育，强的Notch信号促使ILC2发育[16-17]。ILC2均可以通过多种效应细胞因子调控不同信号通路，在多种疾病的发生中发挥重要作用[18]。所以，推测Notch信号途径可能通过作用于其他靶基因调控免疫细胞的分化和发育在儿童结核病中发挥作用，为进一步深入儿童结核病发病机制的研究奠定了基础。
Notch信号途径的每一受体或者配体所发挥的作用不同，促使机体产生的免疫应答不一样，对疾病免疫平衡的影响也不一样[19-20]。研究发现，T细胞上Notch1或Notch2的表达，小鼠体内产生Th2细胞免疫反应[19]。本课题组前期研究发现，结核病患儿体内IL-9 mRNA水平升高，IL-9为Th2型细胞因子[21]，是否本研究结核病患儿中Notch1和Notch2表达增高与IL-9有关，有待进一步深入研究。
综上所述，由于儿童与成人机体免疫存在一定的差距，导致其与成人结核病发病机制不同，虽本课题组前期研究发现了Notch信号途径参与成人结核病Th1/Th2失衡，但从本研究结果可以看出，在儿童与成人结核病外周血中Notch信号途径各分子mRNA水平存在差异，提示Notch信号途径可能在儿童与成人结核病中发挥作用机制有所不同，不能单纯的将Notch信号途径在成人结核病中的作用套用在儿童结核病中，本课题组将进一步应用动物模型深入研究Notch信号途径在儿童结核病中的作用。
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