2019, Vol. 21
2. 湖南省人民医院/湖南师范大学附属第一医院临床研究所, 湖南 长沙 410005;
3. 湖南省人民医院/湖南师范大学附属第一医院超声科, 湖南 长沙 410005;
4. 湖南省人民医院/湖南师范大学附属第一医院医学检验科, 湖南 长沙 410005
川崎病（Kawasaki disease, KD）是一种急性、自限性且病因不明的儿童常见的免疫相关性血管炎综合征，主要累及冠状动脉。虽经静脉免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin, IVIG）治疗，KD患者仍可出现冠状动脉损伤（coronary artery lesion, CAL）及冠状动脉瘤[1]。近年来，KD的发病率有逐年上升趋势，是儿童后天获得性心脏病最常见病因之一[2]。KD病因及发病机制尚未完全明了，目前研究认为其发病与感染、免疫活化、遗传易感性及细胞因子分泌、超抗原、血管内皮功能紊乱等有关[3-4]。
急性KD患者的全基因组表达谱分析已确定了白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）途径激活在炎症介质谱中的关键作用[5]，同时也与儿童时期KD和复发性发热综合征之间的表型相似，并指出炎性体激活在KD免疫发病机制中的潜在作用。炎性体是参与感知先天免疫中的危险信号的多蛋白复合物，其中Nod样受体蛋白3（Nod-like receptor protein 3, NLRP3）激活是炎症激活的关键，也是目前研究最多的炎症小体。目前发现NLRP3的突变与儿童期反复发烧/自身炎症综合征有关[6]。NLRP3与接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein, ASC）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate-specific proteases-1, caspase-1）结合后形成炎症小体，通过调控caspase-1活化，促进IL-1β及IL-18等炎症因子成熟、释放，发挥促炎作用。
目前国内外对于NLRP3在KD及冠脉病变发生中的作用及机制的研究甚少。有研究使用肌醇三磷酸3-激酶C（ITPKC）缺陷小鼠建立KD动物模型，发现ITPKC通过调节钙离子动员来控制NLRP3活化[7]。另有研究发现，在干酪乳酸杆菌细胞壁提取物诱导的KD动物模型组中，内皮细胞NLRP3炎症小体激活增加，其机制与冠状动脉炎期间溶酶体失衡有关[8]。本研究通过检测KD患儿的NLRP3炎症小体及下游IL-1β的表达水平，探讨NLRP3炎症小体与KD急性炎症反应及CAL的相关性。
1 资料与方法 1.1 研究对象和分组前瞻性地纳入2017年1~10月在我院儿童心内科住院的初发的KD患儿42例（病程在7 d以内），其中男25例，女17例。最小年龄为2个月，最大年龄为6岁，平均年龄为31±20个月。
纳入标准：（1）根据2017年美国心脏学会更新的KD诊断标准[2]确诊为KD；（2）未接受过IVIG治疗的初发患儿；（3）有完整的临床及实验室检查资料。
另外选取在我院体检的15例健康儿童作为健康对照组，其中男9例，女6例，平均年龄30±18个月。选取15例于我院住院的肺炎患儿作为发热对照组，其中男9例，女6例，平均年龄29±17个月。发热对照组的纳入标准：（1）符合社区获得性肺炎的诊断标准[9]；（2）发热时间 > 4 d；（3）排除既往有KD病史者。KD组与肺炎发热组、健康对照组性别、年龄的比较差异无统计学意义（P > 0.05）。所有KD患儿行心脏超声心动图检查，根据2017年美国心脏学会更新的KD诊断及治疗指南[2]，按照冠状动脉受累程度（冠脉Z值）分级标准分为CAL组和无CAL组（NCAL组）。CAL组9例，NCAL组33例。KD患儿均在确诊10 d内接受IVIG治疗。
本研究获得湖南省人民医院医学伦理委员会批准（批准文号：2016053）及研究对象家属的知情同意。
1.2 标本采集KD组及发热对照组患儿于入院第1天（急性期），健康对照组儿童于健康体检时，采集两份外周静脉血，1份为非抗凝血，离心后收集血清；另一份为EDTA抗凝血，分离外周血单个核细胞，加1 mL Trizol（美国Invitrogen公司）裂解后待提取RNA，两份血液标本均保存于-80℃冰箱。
1.3 实时荧光定量PCR检测细胞中的NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表达取外周血单个核细胞，加入细胞裂解液，按Trizol法提取总RNA（美国Invitrogen公司），按RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）说明配制mRNA逆转录体系，逆转录合成cDNA。引物序列：NLRP3上游引物为5' -ATGTGGGGGAGAATGCCTTG-3' ，下游引物为5' -TTGTCTCCGAGAGTGTTGCC-3' ；caspase-1上游引物为5' -CATCCCACAATGGGCTCTGT-3' ,下游引物为5' -GCATCTGCGCTCTACCATCT-3' 。ASC上游引物为5' -ATCCAGGCCCCTCCTCAG-3' ,下游引物为5' -AGAGCTTCCGCATCTTGCTT-3' （190 bp）。PCR反应条件为：94℃预变性3 min，共40个循环（94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s），每个循环在72℃延伸阶段收集荧光。每个样品设3个平行复孔。使用2-△△Ct法计算外周血NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA相对表达量。
1.4 IL-1β、IL-6及其他生化指标的测定采用ELISA法检测血清中细胞因子IL-1β和IL-6水平，其试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司（KHB公司）。
其他常规检查，包括血常规、C反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR）、降钙素原（PCT）等血液生化指标的检测，由我院检验科完成。
1.5 心脏彩超结果判定心脏超声心动图检查由我院心脏彩超室完成。按照波士顿儿童医院Z值计算系统（http://www.bostonzscores.com/）评估是否存在CAL：Z值< 2为未合并CAL：Z值≥2.5或Z值在2.0~ < 2.5之间，伴冠状动脉周围回声增强或冠状动脉缺乏正常的逐渐变细为合并CAL。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）[M（P25，P75）]表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用Nemenyi检验；相关性分析采用Spearman秩相关分析法。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 KD组与发热对照组实验室指标检测结果急性期KD患儿ESR、CRP、PCT、IL-6水平明显高于发热对照组（P < 0.05），而前白蛋白（PA）水平则明显低于发热对照组（P < 0.05）；血小板（PLT）计数、血浆白蛋白（ALB）水平在两组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。
| 表 1 KD组和发热对照组实验室各检测指标的比较 （x±s）或[M（P25，P75）] |
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KD组急性期外周血NLRP3炎症小体（NLRP3、caspase-1、ASC）mRNA相对表达量显著高于发热对照组和健康对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。KD组IL-1β水平显著高于健康对照组（P < 0.05），但和发热对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
| 表 2 各组儿童NLRP3炎症小体mRNA相对表达量和细胞因子IL-1β水平的比较 [M（P25，P75）] |
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CAL组NLRP3 mRNA相对表达量明显高于NCAL组，差异有统计学意义（P < 0.05）；IL-1β水平在CAL组较NCAL组稍高，但差异无统计学意义（P > 0.05）；CAL组CRP水平明显高于NCAL组（P < 0.05）。其他实验室检测指标在两组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 3。
| 表 3 KD患儿NCAL组和CAL组间NLRP3 mRNA等指标的比较 （x±s）或[M（P25，P75）] |
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KD患儿急性期NLRP3 mRNA的表达水平与CRP、IL-6及IL-1β水平呈正相关（P < 0.05），与PA水平呈负相关（P < 0.05）；KD患儿急性期IL-1β的表达水平与CRP、ESR、PCT、IL-6、ALB、PA水平均无相关性（P > 0.05）。见表 4。
| 表 4 KD急性期NLRP3 mRNA相对表达量和IL-1β与各临床指标的相关性 |
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NLRP3炎症小体是目前最具代表性的炎症小体，是由NLRP3、ASC以及caspase-1蛋白共同组成的蛋白复合物。当机体遇到外源病原毒素侵袭或内源危险信号刺激时，衔接蛋白ASC招募效应蛋白pro-caspase-1，装配形成炎症小体，炎症小体自我激活后切割pro-caspase-1发生水解，成为具有活性的caspase-l [10-11]，并进一步促进下游更多的促炎因子（如IL-1β、IL-18）成熟，从而促进细胞凋亡，调节固有免疫并发挥生物学功能[12]。而炎症因子的产生可进一步引起免疫细胞如T细胞、NK细胞等的激活和干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子的释放，这种反复发生、甚至扩散的炎症，导致血管内皮的损伤，可能在KD全身血管炎症及CAL中发挥作用。
NLRP3炎性小体是天然免疫系统的重要组成部分，参与机体免疫反应和炎症性疾病的发生[13]。研究发现，类风湿性关节炎患者的外周血细胞中，NLRP3和NLRP3介导的IL-1β分泌明显增加[14]。支气管哮喘小鼠模型中NLRP3 mRNA表达显著增加，通过介导对IL-1β的表达使哮喘恶化，NLRP3炎症小体与哮喘病情严重程度有关[15]。NLRP3基因缺陷的小鼠感染结肠炎的易感性明显增加[16]。NLRP3、ASC基因敲除的骨髓移植入LDL受体缺陷的小鼠进行高脂饮食喂养, 其动脉硬化程度及炎症反应有明显减轻[17]。NLRP3炎症小体的形成和激活不仅发生在免疫细胞如巨噬细胞中，还发生在其他血管细胞如内皮细胞、纤维细胞中，这表明无论早期、中期还是晚期，NLRP3炎症小体均有参与心血管疾病的发生[18-19]。KD是自身免疫性血管炎性疾病, 发病机制目前仍不清楚。免疫系统的高度活化及免疫损伤性血管炎是KD的显著特征。研究发现在注射干酪乳杆菌细胞壁提取物的KD动物模型中，血管内皮内NLRP3的激活与KD的冠状动脉炎有关[8]。本研究采用荧光定量PCR法检测外周血NLRP3炎症小体的表达量，发现KD患儿急性期NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA的表达较健康对照组和发热对照组明显升高，与Alphonse等[20]的研究结果一致，表明NLRP3炎症小体参与了KD的发生发展过程，NLRP3炎症小体的激活在KD早期诊断中可能有重要的临床意义。KD患者的主要病变为中小血管，尤其是冠状动脉的损害。因此本研究对比了CAL和NCAL组外周血NLPR3 mRNA表达的改变，发现CAL组NLRP3 mRNA的表达显著高于NCAL组，这也进一步表明NLRP3炎症小体活化在KD血管炎形成及进一步发展成CAL过程中可能有重要作用。研究还发现ITPKC通过调节钙离子的流动介导NLRP3炎症小体的活化，从而参与KD的发生发展[7]。因此我们推测，在急性期进行外周血NLRP3炎症小体的检测并进行相关干预，可能对KD的早期诊断及预防CAL的发生起一定的作用。
为进一步研究NLRP3激活后如何促进KD的血管炎症反应，本研究采用ELISA方法检测下游炎症因子IL-1β的表达，发现KD患儿血清IL-1β的表达水平明显高于健康对照组，这与国内外的研究结果一致[20-21]。IL-1β属于IL-1家族，目前研究发现IL-1信号通路的激活在KD的发生机制中起重要的作用[22]。Wakita等[23]在KD小鼠模型中发现，冠状动脉瘤的形成是由IL-1α和IL-1β两者共同介导的，通过IL-1受体拮抗剂阿那白滞素拮抗IL-1受体、阻断IL-1信号通路，可减少冠脉瘤的发生。IL-1β为强有力的促炎细胞因子，还可以促进TNF-α、IL-6和血管内皮黏附分子等的表达，这些因子均与KD的发病相关联。IL-1β能激活血小板衍生生长因子和前凝血因子，增加内皮素和前列腺素的合成，增加体内脂质过氧化物的产生，造成凝血功能障碍、血管内皮损伤、血管壁通透性增加。本研究发现NCAL和CAL组的IL-1β表达无明显差别，提示IL-1β的升高与KD的发生有关，但不能早期预测CAL的发生。另外，本研究对KD患儿急性期外周血NLRP3 mRNA表达和IL-1β水平之间的相关性进行分析，发现NLRP3 mRNA表达与IL-1β水平存在正相关关系，这表明急性期NLRP3 mRNA表达活性增强，进一步促进了IL-1β的分泌，二者可能共同参与了KD血管炎症及CAL的发生。
CRP、PCT、ESR、ALB、PA、IL-6是判断炎症活动度的常用指标，与KD的严重程度相关[24-25]。2017年美国心脏学会将CRP、ESR、PCT作为评估KD严重程度及不完全KD的诊断指标[2]。本研究发现，KD组ESR、CRP、PCT、IL-6水平明显高于发热对照组，这与国内外的研究一致[2, 21]，提示急性期KD患儿的炎症反应程度明显高于肺炎发热患儿。本研究还发现KD组PA的水平明显低于发热对照组，与国内的研究结果一致[25]，提示PA可作为一项早期诊断KD的参考指标。本研究对KD患儿急性期外周血NLRP3 mRNA、IL-1β与CRP、PCT、IL-6、ALB、PA进行相关性分析发现，KD患儿急性期NLRP3 mRNA的表达水平与CRP和IL-6水平呈正相关，与PA呈负相关，IL-1β与各指标无显著相关性。因此，推测NLRP3可作为反映KD患儿疾病活动性的新指标。
综上所述，本研究显示，NLRP3炎症小体可能参与了KD急性期炎症反应及CAL的发生。早期检测外周血NLRP3炎症小体的表达并进行干预治疗，可能为KD的诊治及CAL的防治提供新的思路。但本研究存在样本量小等局限性，需进一步大规模深入研究NLRP3炎症小体的激活机制以及其与KD血管炎及CAL的关系。
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