2019, Vol. 21
2. 暨南大学附属第一医院新生儿监护室, 广东 广州 510632
MDR3蛋白是一种参与胆汁卵磷脂分泌的肝毛细胆管膜转运蛋白，胆汁卵磷脂可以乳化胆盐、胆固醇，防止胆固醇沉淀及胆盐损伤胆管上皮。编码MDR3蛋白的MDR3基因的表达水平高低可影响胆汁卵磷脂的浓度及作用强度。MDR3的表达降低会导致卵磷脂囊泡胆固醇分泌减少，也可以导致胆管损伤、炎症，胆石沉积及其造成的肝损伤[1]。随着基因学的发展，越来越多的证据表明，部分成人及婴儿的肝内胆汁淤积症出现MDR3基因mRNA表达下降，而且研究显示MDR3基因突变在肝内胆汁淤积症的发病机制中发挥重要作用[2-4]。近年来随着新生儿抢救技术的不断提高，使得许多极低、超低出生体重儿得以存活，其中胃肠外营养（parenteral nutrition, PN）起到了关键性作用，大大提高了早产儿的生存率，明显降低了病死率。但由于早产儿的特殊生理、病理特征，PN所致并发症时有发生。PN的并发症包括：败血症、代谢不平衡、血栓栓塞及肝胆损伤等，其中PN相关性胆汁淤积（parenteral nutrition associated cholestasis, PNAC）日益受到重视。至今PNAC的发病机制不明确，其发病涉及因素考虑为：早产、低出生体重、PN持续时间长、禁食致缺乏胃肠道刺激、感染、肠道细菌过度生长、细菌移位、全PN溶液的营养成分失衡、微量元素缺乏及PN的有毒成分等，引起肝脏损害，主要表现为肝细胞脂肪变性及胆汁淤积。那么MDR3基因是否在早产儿PNAC的发病中也起到重要的作用呢？本研究采用实时定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）技术[5]检测PNAC早产儿外周血细胞中MDR3 mRNA表达，动态观察早产儿生化指标变化情况，以探讨MDR3基因与早产儿PNAC发病的相关性。
1 资料与方法 1.1 研究对象2011年6月至2017年11月中山大学附属中山医院收治的行PN超过14 d的早产儿共755例，选取其中患PNAC的早产儿76例为PNAC组，男48例，女28例，胎龄215±17 d，PN应用时间23±5 d；采用随机数字表法从未出现PNAC的679例早产儿（男407例，女272例）中随机抽取80例为非PNAC组，男50例，女30例，胎龄217±18 d，PN应用时间22±6 d。两组胎龄、性别、PN应用时间等方面进行比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。本研究为前瞻性研究，已通过医院伦理委员会审批，并且已告知患儿家长并获得家属同意。
1.2 PNAC的诊断标准PNAC诊断标准参考文献[6]，纳入标准为：早产儿，PN超过2周；临床主要表现为黄疸、肝脾肿大、大便颜色变淡，严重者可出现白陶土样大便；肝功能提示丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、直接胆红素（DBil）、总胆汁酸（TBA）升高，且血清DBil水平 > 2 mg/dL或DBil水平占总胆红素（TBil） > 20%。
1.3 排除标准研究对象均常规进行血培养，以及肝炎系列病毒抗体-IgM、巨细胞病毒、梅毒、细小病毒等检测，排除甲型、乙型、丙型肝炎病毒及巨细胞病毒等病毒感染；进行血常规、血糖、CRP、肝胆生化指标等检查；出现胆汁淤积者行肝胆超声、放射性核素肝胆显像（ECT）和胰肝胆的磁共振胆管成像（MRCP）检查，排除肝外胆道闭锁、先天性胆总管囊肿、胆管扩张、肿块压迫和血管瘤等外科疾病引起的胆汁淤积性肝病；并除外希特林蛋白缺乏症（citrin缺陷）、半乳糖血症、酪氨酸血症等常见遗传代谢性疾病引起的胆汁淤积性肝病。
1.4 肝胆生化指标及纤维化指标检测所有研究对象分别于生后第1天、第14天、第30天、第60天、第90天动态检测血清肝胆生化指标，包括ALT、γ-谷氨酰胺转移酶（γ-GT）、TBil、DBil、TBA；纤维化指标，包括透明质酸（HA）、层黏连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原N端肽（PCIIINP）、Ⅳ型胶原（IV-COL）。
1.5 RT-qPCR法检测MDR3 mRNA表达采用TRIzol试剂盒（Invitrogen公司，美国）提取外周血标本总RNA，然后使用Nanodrop 2000/2000c分光光度计（Thermo公司，美国）检测总RNA浓度。采用M-MLV逆转录试剂盒（Invitrogen公司，美国）将提取的总RNA逆转录为cDNA。应用MDR3基因引物扩增，引物由美国Invitrogen公司设计和合成，MDR3上游引物：5'-TGGCCCTGGTTGGAAGTAGTG-3'，下游引物：5'-AGAAGGATCTTGGGGTTGCGAA-3'，片段长度391 bp；β-actin上游引物：5'-AGTTGCGTTACACC-CTTTCTTG-3'，下游引物：5'-CACCTTCACCGTTCC-AG-3'，片段长度149 bp。反应体系：2×SuperReal PreMix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL，cDNA模板1.5 μL，RNase-free ddH2O补至20 μL。PCR反应条件：95℃预变性15 min；95℃变性10 s，61.4℃退火20 s，72℃延伸20 s，40个循环。扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，每个样本重复反应3次，取平均Ct值作为每个样本的Ct值。以β-actin作为内参基因行相对定量，MDR3基因为目的基因，计算各组外周血细胞中MDR3基因的△△Ct值，△△Ct=（Ct目的基因-Ct内参基因）实验组-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照组，则目的基因的表达量=2-△△Ct。
1.6 统计学分析应用SPSS 20.0统计学软件对结果进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验；计数资料采用百分率（%）表示，两组间比较采用χ2检验；两变量间关系的密切程度采用Pearson相关性分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 肝胆生化指标比较PNAC组与非PNAC组在不同日龄的肝胆生化指标，结果提示：PNAC组与非PNAC组在生后第1天的血清肝胆生化指标（ALT、TBil、DBil、TBA、γ-GT）水平比较差异无统计学意义（P > 0.05），PNAC组在生后第14、30、60、90天的血清肝胆生化指标水平均高于非PNAC组（P < 0.05）（表 1）；PNAC组中血清肝胆生化指标水平在生后14 d上升，至生后30 d达最高峰，生后60 d下降。
| 表 1 PNAC组与非PNAC组在不同日龄的血清肝胆生化指标水平的比较（x±s） |
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比较PNAC组与非PNAC组在不同日龄的血清纤维化指标（HA、LN、PCIIINP、IV-COL）水平，结果提示：生后第1天的血清纤维化指标水平在PNAC组与非PNAC组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05），生后第14、30、60、90天的血清纤维化指标水平在PNAC组明显高于非PNAC组（P < 0.05）（表 2）。PNAC组中血清纤维化指标水平在生后14 d上升，生后30 d达最高峰，生后60 d下降。
| 表 2 PNAC组与非PNAC组在不同日龄的血清纤维化指标水平的比较（x±s，ng/mL） |
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PNAC组外周血细胞中MDR3 mRNA的相对定量表达水平（2.7±1.6）高于非PNAC组（1.0±0.6，t=8.783，P < 0.05）。
2.4 PNAC组外周血MDR3 mRNA相对表达量与生后第30天血清肝胆生化指标的相关分析结果显示，PNAC组患儿外周血细胞的MDR3 mRNA相对表达量与PNAC患儿生后第30天血清ALT、TBil、DBil、TBA、γ-GT的水平均呈负相关（P < 0.001），见表 3。
| 表 3 PNAC组外周血MDR3 mRNA相对表达量与生后第30天血清肝胆生化指标相关分析结果 |
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MDR3基因编码毛细胆管上磷脂载体的转运蛋白参与正常胆汁酸的转运和分泌，在胆汁淤积过程中起重要作用。国内外文献报道MDR3基因的mRNA在人正常组织普遍表达，在胆汁淤积性疾病患者中，部分表现为失活或低表达，部分表现为高表达，因而MDR3基因表达的改变可以是胆汁淤积发生的原因，也可以是胆汁淤积发生后的代偿性反应[7-11]。
国内外学者关于各种病因导致的胆汁淤积性肝病患者外周血细胞MDR3基因mRNA的表达情况结果各有异同。Chen等[12]发现在婴儿胆道闭锁早期MDR3 mRNA表达下降，可能与FXR下调有关，然而随着病情的发展，晚期患儿MDR3 mRNA的表达增强，与FXR mRNA表达回升有关。赵国翠[13]对妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）的孕妇的外周血细胞MDR3 mRNA进行检测后发现，与正常孕妇组对比，两组间MDR3 mRNA水平比较差异无统计学意义。曾慧[14]对ICP孕妇的胎盘MDR3 mRNA及其蛋白进行检测后发现，上述指标在ICP孕妇胎盘中的表达弱于正常孕妇组。Anselmo等[15]对成人肝移植后胆汁淤积的研究结果显示，患者早期即出现MDR3 mRNA的表达增强。Trauner等[16]学者研究发现大部分原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者外周血细胞MDR3 mRNA表达增高，但也有少部分由于MDR3基因存在无义突变或错义突变杂合子而出现外周血细胞MDR3 mRNA表达下降。苏亚非等[17]对MDR3基因在胆囊胆固醇结石形成的作用进行研究，结果发现胆囊胆固醇结石患者的MDR3 mRNA表达显著低于肝炎组及正常对照组，提示MDR3基因的表达水平在胆囊胆固醇结石的形成过程中起重要作用。家族性进行性肝内胆汁淤积症Ⅲ型和低磷脂相关性胆汁淤积症由于MDR3基因突变而出现外周血细胞MDR3 mRNA表达下降[18-21]。
本研究结果显示76例PNAC早产儿外周血细胞MDR3 mRNA表达水平高于非PNAC组，其原因可能与PNAC早产儿发生肝内胆汁淤积导致胆汁酸升高后通过蛋白激酶C途径上调mdr2的转录活性有关[22]，MDR3 mRNA表达增高有利于促进磷酸的分泌增高，与过多的胆盐结合以减轻胆盐对胆管上皮细胞的损害，是人体适应性的代偿反应。这与国内外关于婴儿胆汁淤积性肝炎患儿的外周血细胞MDR3 mRNA表达的研究结果相似[23]。
本研究结果显示，在生后第1天的血清肝胆生化和纤维化指标水平在PNAC组与非PNAC组之间比较差异无统计学意义，PNAC组在生后第14、30、60、90天的血清肝胆生化和纤维化指标水平明显高于非PNAC组，这与长时间静脉营养引起胆汁淤积性肝病后导致肝损害有关[24-25]。PNAC组中血清肝胆生化和纤维化指标水平在生后第14天逐渐上升，在生后第30天达最高峰，生后第60天逐渐下降，这考虑与本研究中PNAC组大多数PNAC早产儿在生后第60天已停用胃肠外营养和经过护肝利胆治疗后肝损害逐渐好转有关。唐清等[26]学者对婴儿肝内胆汁淤积症患儿的外周血细胞MDR3 mRNA表达与肝胆生化指标相关性分析研究的结果显示，外周血细胞MDR3 mRNA表达与肝胆生化指标无相关性。而本研究结果显示外周血细胞的MDR3 mRNA表达水平与PNAC患儿生后第30天的血清ALT、TBil、DBil、TBA、γ-GT水平呈负相关，提示外周血细胞MDR3 mRNA的表达水平越低，胆汁淤积导致的肝损害越严重, 这结果异于唐清等[26]学者的研究。本研究结果提示虽然MDR3 mRNA低表达并不是PNAC早产儿发病的主要因素，但当MDR3 mRNA相对低表达时，同样会影响胆汁的代谢，从而加重PNAC早产儿的胆汁淤积和肝胆损害的程度。
综上所述，本研究结果显示大多数PNAC患儿的外周血MDR3 mRNA表现为高表达，提示MDR3 mRNA表达水平下降并非PNAC的主要致病因素。然而76例PNAC早产儿中有4例的外周血MDR3 mRNA的表达水平低于正常对照组，那么这4例病例是否由于存在MDR3基因突变而引起MDR3 mRNA低表达，从而导致肝内胆汁淤积的发生呢？本研究将进一步对所有研究对象MDR3基因的28个外显子的突变位点进行分析，以明确MDR3基因是否是早产儿PNAC致病的易感基因之一。
| [1] |
Fujikura K, Yamasaki T, Otani K, et al. BSEP and MDR3:useful immunohistochemical markers to discriminate hepatocellular carcinomas from intrahepatic cholangiocarcinomas and hepatoid carcinomas[J]. Am J Surg Pathol, 2016, 40(5): 689-696. DOI:10.1097/PAS.0000000000000585 (  0) |
| [2] |
Aamann L, Ørntoft N, Vogel I, et al. Unexplained cholestasis in adults and adolescents:diagnostic benefit of genetic examination[J]. Scand J Gastroenterol, 2018, 53(3): 305-311. DOI:10.1080/00365521.2017.1422800 ( 0) |
| [3] |
Gordo-Gilart R, Hierro L, Andueza S, et al. Heterozygous ABCB4 mutations in children with cholestatic liver disease[J]. Liver Int, 2016, 36(2): 258-267. DOI:10.1111/liv.2016.36.issue-2 ( 0) |
| [4] |
Degiorgio D, Crosignani A, Colombo C, et al. ABCB4 mutations in adult patients with cholestatic liver disease:impact and phenotypic expression[J]. J Gastroenterol, 2016, 51(3): 271-280. DOI:10.1007/s00535-015-1110-z ( 0) |
| [5] |
李静, 谭彩虹. 血浆microRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 国际检验医学杂志, 2015, 36(1): 57-59. DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.01.024 ( 0) |
| [6] |
夏世文. 早产儿胃肠外营养相关性胆汁淤积[J]. 中国新生儿科杂志, 2011, 26(5): 289-292. DOI:10.3969/j.issn.1673-6710.2011.05.001 ( 0) |
| [7] |
Carey AN, Zhang W, Setchell KDR, et al. Hepatic MDR3 expression impacts lipid homeostasis and susceptibility to inflammatory bile duct obstruction in neonates[J]. Pediatric Res, 2017, 82(1): 122-132. DOI:10.1038/pr.2017.78 ( 0) |
| [8] |
Zhao G, Xu D, Yuan Z, et al. 8-Methoxypsoralen disrupts MDR3-mediated phospholipids efflux and bile acid homeostasis and its relevance to hepatotoxicity[J]. Toxicology, 2017, 386: 40-48. DOI:10.1016/j.tox.2017.05.011 ( 0) |
| [9] |
Zollner G, Thueringer A, Lackner C, et al. Alterations of canalicular ATP-binding cassette transporter expression in druginduced liver injury[J]. Digestion, 2014, 90(2): 81-88. DOI:10.1159/000365003 ( 0) |
| [10] |
Khabou B, Durand-Schneider AM, Delaunay JL, et al. Comparison of in silico prediction and experimental assessment of ABCB4 variants identified in patients with biliary diseases[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2017, 89: 101-109. DOI:10.1016/j.biocel.2017.05.028 ( 0) |
| [11] |
Morita SY, Terada T. Molecular mechanisms for biliary phospholipid and drug efflux mediated by ABCB4 and bile salts[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014: 954781. ( 0) |
| [12] |
Chen HL, Liu YJ, Chen HL, et al. Expression of hepatocyte transporters and nuclear receptors in children with early and late-stage biliary atresia[J]. Pediatr Res, 2008, 63(6): 667-673. DOI:10.1203/PDR.0b013e318170a6b5 ( 0) |
| [13] |
赵国翠. 妊娠肝内胆汁淤积症患者MDR3基因突变的研究[J]. 中国卫生产业, 2013, 32(11): 124-125. ( 0) |
| [14] |
曾慧. 胎盘中转运蛋白表达水平对胆汁酸排泌的影响[J]. 东南大学学报(医学版), 2016, 35(6): 913-917. DOI:10.3969/j.issn.1671-6264.2016.06.017 ( 0) |
| [15] |
Anselmo DM, Ghobrial RM, Jung LC, et al. New era of liver transplantation for hepatitis B:a 17-year single-center experience[J]. Ann Surg, 2002, 235(5): 611-619. DOI:10.1097/00000658-200205000-00002 ( 0) |
| [16] |
Trauner M, Fickert P, Wagner M. MDR3(ABCB4) defects:a paradigm for the genetics of adult cholestatic syndromes[J]. Semin Liver Dis, 2007, 27(1): 77-98. ( 0) |
| [17] |
苏亚非, 宋敏, 周蓉蓉, 等. Mucin-3和MDR3在胆固醇结石形成中的作用[J]. 齐鲁医学杂志, 2011, 26(1): 46-48. ( 0) |
| [18] |
Park HJ, Kim TH, Kim SW, et al. Functional characterization of ABCB4 mutations found in progressive familial intrahepatic cholestasis type 3[J]. Sci Rep, 2016, 6: 26872. DOI:10.1038/srep26872 ( 0) |
| [19] |
Delaunay JL, Durand-Schneider AM, Dossier C, et al. A functional classification of ABCB4 variations causing progressive familial intrahepatic cholestasis type 3[J]. Hepatology, 2016, 63(5): 1620-1631. DOI:10.1002/hep.v63.5 ( 0) |
| [20] |
Schatz SB, Jüngst C, Keitel-Anselmo V, et al. Phenotypic spectrum and diagnostic pitfalls of ABCB4 deficiency depending on age of onset[J]. Hepatol Commun, 2018, 2(5): 504-514. DOI:10.1002/hep4.v2.5 ( 0) |
| [21] |
Cardoso MF, Branco E JC, Anapaz V, et al. A complex case of cholestasis in a patient with ABCB4 and ABCB11 mutations[J]. GE Port J Gastroenterol, 2018, 25(4): 189-194. DOI:10.1159/000484612 ( 0) |
| [22] |
Fuchs CD, Paumgartner G, Mlitz V, et al. Colesevelam attenuates cholestatic liver and bile duct injury in Mdr2-/-mice by modulating composition, signalling and excretion of faecal bile acids[J]. Gut, 2018, 67(9): 1683-1691. DOI:10.1136/gutjnl-2017-314553 ( 0) |
| [23] |
Lammert F, Matern S. The genetic background of cholesterol gallstone formation:an inventory of human lithogenic genes[J]. Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord, 2005, 5(2): 163-170. DOI:10.2174/1568008054064841 ( 0) |
| [24] |
宋诗蓉, 吴捷. 早产儿胃肠外营养相关性胆汁淤积症临床研究[J]. 国际儿科学杂志, 2017, 44(4): 286-290. DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4408.2017.04.017 ( 0) |
| [25] |
张韶明, 陈茂琼, 陈晓霞. 早产儿胃肠外营养相关性胆汁淤积症研究进展[J]. 世界最新医学信息文摘, 2017, 17(26): 52-53. ( 0) |
| [26] |
唐清, 王琳琳, 单庆文, 等. 熊去氧胆酸对婴儿胆汁淤积性肝炎多药耐药蛋白3及法尼醇受体基因表达的影响和意义[J]. 中国当代儿科杂志, 2013, 15(9): 756-758. ( 0) |