2019, Vol. 21
2. 郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院/郑州儿童医院 呼吸科, 河南 郑州 450000
2. Department of West District General Internal Medicine, Children's Hospital Affiliated to Zhengzhou University/Henan Children's Hospital/Zhengzhou Children's Hospital, Zhengzhou 450000, China
儿童支气管哮喘是由多种炎症细胞及细胞因子共同参与的一种以呼吸道变应性和非特异性气道高反应性为特征的多因性慢性炎症疾病，在全球范围内的发生率逐年增加[1]。研究表明，白三烯作为一种重要的气道炎症介质参与哮喘发病的多个环节，通过增加气道炎症和气道高反应性，导致难治性哮喘的发生[2-3]，而白三烯受体拮抗剂也已广泛应用于儿童哮喘的治疗。近年的研究表明，白三烯受体拮抗剂临床疗效存在个体差异，与白三烯C4合成酶、5-脂氧化酶等多种基因多态性呈明显相关性[4]。胞浆型磷脂酶A2基因（PLA2G4）能够编码胞浆型磷脂酶A2（cPLA2），水解膜磷脂，释放花生四烯酸，产生白三烯等二十烷酸类炎性介质、参与气道高反应性，与哮喘等慢性气道炎症的发生发展密切相关[5]，因此推测PLA2G4基因多态性可能通过影响cPLA2的表达或活性而影响白三烯等物质的合成，从而影响哮喘的发生发展以及白三烯受体拮抗剂的疗效。目前已有研究证实PLA2G4基因是成人哮喘的易感基因[6]，但PLA2G4基因多态性与儿童哮喘发生及白三烯受体拮抗剂疗效是否有关尚不清楚。因此，本研究拟通过分析河南汉族支气管哮喘患儿与健康儿童PLA2G4基因rs932476位点基因型和等位基因频率的差异及孟鲁司特治疗后的疗效差异，探讨PLA2G4基因rs932476位点多态性与儿童支气管哮喘发生及白三烯受体拮抗剂疗效的关系。
1 资料与方法 1.1 研究对象病例来自于2015年10月至2017年10月郑州大学附属儿童医院诊治的持续性哮喘患儿。纳入标准：（1）符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组修订的《支气管哮喘防治指南》中持续性哮喘的诊断标准[7]，非急性发作期患儿；（2）入组前2周未使用免疫调节剂治疗；（3）治疗依从性良好，临床资料完整；（4）河南省汉族儿童。排除标准：（1）合并其他严重疾病（结核、麻疹、水痘等传染病以及先天性心脏病、免疫缺陷病、肝肾功能衰竭、遗传代谢性疾病等）；（2）合并慢性支气管炎、支气管扩张等疾病；（3）对本研究中的药物过敏，不宜接受本研究方案的患者。最终纳入支气管哮喘患儿128例为病例组，其中男68例，女60例；年龄2~5岁，平均3.2±1.1岁。按照慢性持续期哮喘病情严重程度进行分级[7]：轻度患儿23例，中度77例，重度28例。选择同期在我院体检的健康儿童100例为对照组，其中男55例，女45例，年龄1~5岁，平均3.0±1.0岁。两组受试儿童在年龄、性别等一般资料的比较中差异无统计学意义（P > 0.05）。本研究经郑州大学附属儿童医院伦理委员会批准，患儿家属均签署知情同意书。
1.2 治疗方法病例组患儿根据疾病的发作及严重程度给予常规的雾化平喘、祛痰止咳，以及抗感染、吸入糖皮质激素等对症治疗：喘息发作时吸入沙丁胺醇，合并感染者进行抗感染治疗等。所有患儿睡前口服孟鲁司特纳（顺尔宁，杭州默沙东有限公司，国药准字：J20140167），每天4 mg/次，连续治疗2个月。2个月后若病情稳定，可遵医嘱逐步减少药物用量。
1.3 PLA2G4基因rs932476位点基因型的检测抽取受试者清晨空腹外周静脉血3 mL于抗凝采血管中，-20℃保存备用。采用全血基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取DNA，采用NCBI中Primer Blast设计并筛选PCR引物。PLA2G4A rs932476上游引物：5' -CCTTCTTCTAACAGCAGGAGGA-3' ，下游引物：5' -CTAAAGATTGGGAGGGTGGGATC-3' ，由上海生工生物工程有限公司合成引物。PCR反应条件：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共30个循环。采用纯化试剂盒纯化PCR产物，纯化后的DNA片段送上海生工生物工程有限公司进行DNA测序鉴定基因型。
1.4 疗效评价观察患儿喘息、哮鸣、咳嗽等症状情况，参照文献评定标准[8]评价其临床疗效。临床控制：症状完全缓解，偶尔轻度发作可自行缓解；显效：症状明显缓解，发作次数显著减少（与同期相比减少2/3）；好转：症状有所缓解，发作次数减少（与同期相比减少1/3）；无效：症状无明显改善甚至加重。总有效率=（临床控制+显效+好转）/总病例数×100%。
1.5 观察指标分别于治疗前及疗程结束后，采集病例组患儿静脉血，3 000 r/min离心10 min分离血清，-20℃保存待用。采用酶联免疫法检测受试者血清中白三烯B4（LTB4）、免疫球蛋白E（IgE）、白细胞介素-4（IL-4）及γ-干扰素（IFN-γ）的水平，严格按照ELISA试剂盒（购自上海酶联生物科技有限公司）说明书进行操作。
采用瑞典NIOX气道炎症检测仪，采集患儿平静时的呼出气体经采样管道至检测仪，检测呼出气一氧化氮（FeNO）水平；而后采用德国JAEGER公司生产的Master Screen肺功能仪检测患儿平静状态下的潮气呼吸肺功能参数：达峰时间比（TPTEF/TE）和达峰容积比（VPEF/VE）。
1.6 统计学分析所有数据均采用SPSS 19.0软件进行分析。符合正态分布的计量资料以均值±标准差（x±s）表示，治疗前后的比较行配对样本t检验；多组间比较行单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验。计数资料采用构成比（%）表示，组间比较采用卡方检验，组间两两比较采用卡方分割法，调整检验水准为0.0167。对于单向有序的分类计数资料，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 rs932476位点基因型及基因频率的比较两组受试者PLA2G4基因rs932476位点的基因型及等位基因的频率如表 1所示。经卡方检验，两组基因型频率的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。AA、AG、GG基因型及等位基因频率在病例组和对照组之间的分布差异无统计学意义（P > 0.05）。以是否患病为因变量，以基因型为自变量进行logistic回归分析，显示AG和GG基因型相对于AA基因型的发病风险分别为1.197和1.433倍，C等位基因携带者相对于A等位基因携带者的发病风险为1.218倍，但差异均无统计学意义（P > 0.05）。同时将病例组患儿按照哮喘的严重程度分为3类：轻度、中度和重度。rs932476位点基因型及等位基因频率在不同程度哮喘组的分布如表 2所示。由表中可以看出，rs932476位点基因型及等位基因频率与哮喘严重程度无明显的相关性（P > 0.05）。
| 表 1 病例组和对照组PLA2G4基因rs932476位点的基因型及等位基因的分布[例（%）] |
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| 表 2 不同严重程度哮喘患儿rs932476位点的基因型及等位基因的分布[例（%）] |
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病例组128例哮喘患儿治疗2个月后，其中41例（32.0%）得到临床控制，37例（28.9%）显效，34例（26.6%）好转，16例（12.5%）无效。不同基因型对应疗效分布如表 3所示，可以看出，不同基因型患儿的疗效分布差异无统计学意义，但AA基因型者总有效率显著高于GG型（P < 0.0167）。
| 表 3 不同基因型患儿的临床疗效的比较[例（%）] |
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治疗前后各基因型对应血清炎性因子水平的变化如表 4所示。与治疗前相比，治疗后各基因型患儿血清IgE和IL-4水平降低，IFN-γ水平升高（P < 0.05）。治疗前各基因型患儿间血清IgE、IL-4及IFN-γ水平差异无统计学意义，治疗后GG型患儿血清IL-4水平高于AA型，IFN-γ的水平低于AA型（P < 0.05）。
| 表 4 不同基因型患儿治疗前后炎症因子的变化（x±s） |
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治疗前后各基因型患儿的肺功能参数及FeNO水平检测结果如表 5所示，从表 5中可以看出，治疗前各基因型患儿的肺功能参数TPTEF/TE和VPEF/VE及FeNO水平差异无统计学意义。治疗后，各基因型患儿的肺功能参数升高，其中AA型患儿显著高于GG型；而FeNO水平治疗后明显下降，其中AA型患儿明显低于GG型（P < 0.05）。
| 表 5 不同基因型患儿治疗前后肺功能的比较（x±s） |
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对照组与病例组两组间及组内各基因型对应血清LTB4水平如表 6所示。可以看出，病例组治疗前血清LTB4水平明显高于对照组（t=32.611，P < 0.001）；治疗后病例组中血清LTB4水平明显降低（P < 0.05）；对照组与病例组两组组内GG基因型患儿LTB4水平高于AA型，差异有统计学意义（P < 0.05）。
| 表 6 不同组间及不同基因型患儿间血清LTB4水平的比较（x±s，ng/mL） |
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白三烯是花生四烯酸经5-脂加氧酶途径代谢产生的炎性介质，在哮喘的发生发展的过程中，抗原-抗体等刺激因素能够激活炎性细胞中的磷脂酶A2，催化膜磷脂水解成花生四烯酸，进而被5-脂加氧酶氧化为不稳定的环化物白三烯A4（LTA4），在LTA4水解酶作用下水解LTB4或在白三烯C4合成酶的催化下形成LTC4等半胱氨酸白三烯（CysLTs），诱导支气管痉挛，引起气道炎症和气道高反应性[9-10]。作为白三烯合成途径的相关酶类，cPLA2可能会影响花生四烯酸的含量进而影响白三烯的产生。因此推测其编码基因PLA2G4多态性可能会影响cPLA2的表达或活性而影响白三烯的合成及哮喘的发生发展。既往研究表明，PLA2G4是多种疾病的潜在易感基因[11-12]。de Jong等[13]研究通过全基因组分析发现PLA2G4基因多态性能够激活p38MAPK通路，导致肺功能受损，进而引发慢性阻塞性肺部疾病。Rava等[14]研究发现PLA2G4基因多态性是成人哮喘的易感基因。本研究发现对照组和病例组中PLA2G4基因rs932476位点GG型血清LTB4的水平明显高于AA型，但该位点各基因型及等位基因频率在病例组和对照组及不同程度哮喘组中的分布差异均无统计学意义，提示该位点多态性可能与白三烯的合成有关，但与哮喘的易感性及严重程度可能不相关。造成该结果的原因可能是：（1）哮喘是多基因遗传病，存在遗传异质性；（2）该位点多态性可能与其他功能多态性位点存在连锁不平衡；（3）该基因产物cPLA2的激活和调节机制较为复杂，受遗传和环境的共同调控；（4）多种PLA2相互作用共同参与类花生酸的产生和白三烯的合成[15-17]。
孟鲁司特作为白三烯特异性拮抗剂，能够与白三烯受体特异性结合，抑制白三烯炎性通路从而减轻气道炎症，调节气道功能，有效改善哮喘临床症状，成为哮喘治疗中的重要药物之一[18]。但白三烯拮抗剂在不同哮喘患儿中存在明显的疗效异质性，目前已知LTC4S和ALOX5等基因多态性均可能影响其疗效[19-20]。本研究主要探究了PLA2G4基因rs932476位点多态性与孟鲁司特疗效的相关性，结果显示，孟鲁司特治疗后AA型患儿的总有效率明显高于GG型患儿，AA型患儿血清炎症因子IL-4的水平明显低于GG型，而IFN-γ水平明显高于GG型，同时AA型患儿的肺功能参数TPTEF/TE和VPEF/VE显著高于GG型，而FeNO水平低于GG型。这些结果显示孟鲁司特对AA型患儿炎症反应的控制及肺功能的改善均优于GG型，提示该位点多态性可能对孟鲁司特的疗效有一定的影响。因此建议临床上针对GG基因型患儿在口服孟鲁司特的同时应加用糖皮质激素等非特异性PLA2拮抗剂，进一步抑制炎症反应，改善哮喘症状。同时本研究还发现，病例组治疗前血清LTB4水平明显高于对照组；治疗后病例组中血清LTB4水平明显降低；治疗后GG型患儿血清LTB4水平显著高于AA型。因此推测该位点多态性对孟鲁司特疗效的影响可能是通过某种途径影响血清LTB4水平实现的。
综上所述，PLA2G4基因rs932476位点多态性可能与儿童支气管哮喘的易感性及病情严重程度无关，但对白三烯受体拮抗剂孟鲁司特的疗效有一定的影响，其机制可能与其对LTB4的影响有关，具体的作用机制还有待进一步研究。本研究的不足之处在于，本研究仅检测了PLA2G4基因rs932476位点多态性, 可能会对结果造成一定的偏倚性；同时本研究受样本量及地域的影响，不能够完全阐述该基因多态性与哮喘发生的关系，需要进一步多中心、大规模的研究，以更全面了解哮喘的发病机制及药物基因组学，为哮喘的临床用药提供理论基础。
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