2019, Vol. 21
2. 新疆乌鲁木齐武警新疆总队医院儿科, 新疆 乌鲁木齐 830000
肾母细胞瘤又称Wilms肿瘤或肾胚胎瘤，是婴幼儿时期最常见的泌尿生殖器恶性肿瘤，占儿童肾脏恶性肿瘤的90%以上[1]，发病高峰年龄在4岁以下[2]，年发病率约为7/100 000[3]，在患儿中多以腹部肿块、血尿等表现就诊。肾脏胚胎发育是一个复杂的过程，受转录因子、原癌基因及生长因子等调控，因而肾母细胞瘤的发生是多病因、多基因、多阶段性的，其基因表达、细胞信号转导通路等与肾母细胞瘤的发生、发展及预后密切相关。国际上有关儿童实体瘤的诊断治疗技术进展很快，近20年肾母细胞瘤的预后得到了很大的改善，目前总体生存率已超过90%[4]。新疆是儿童肾母细胞瘤高发地区之一，由于地域、经济及医疗状态等限制，导致本地区儿童肾母细胞瘤初诊时体积均较大，位于National Wilms Tumor Study Group（NWTSG）和International Society of Pediatric Oncology（SIOP）分期的Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期。因此对相关基因的研究，在肾母细胞瘤的早期诊断、个体化治疗、改善预后等方面具有重要意义。本课题组前期对新疆维吾尔族三胞胎（1例患肾母细胞瘤，2例未患肾母细胞瘤）儿童血液样本进行RNA-seq分析，最终获得199个上调表达差异基因以及250个下调表达差异基因，其中Fra-1基因在肾母细胞瘤患儿中明显高于2例非肾母细胞瘤同胞，由此可见，Fra-1基因与肾母细胞瘤可能存在某种内在联系。因此，本实验通过实时荧光定量PCR检测Fra-1在肾母细胞瘤患儿和正常儿童血液中的表达差异，以及Fra-1在肾母细胞瘤患儿理想疗效组（持续缓解）和疗效不佳组（转移、复发或死亡）的表达差异，探讨Fra-1在儿童肾母细胞瘤的表达及其意义，为后续临床治疗实践提供参考。
1 资料与方法 1.1 研究对象及分组选取2012年12月至2018年1月新疆医科大学第一附属医院收治的肾母细胞瘤患儿50例作为病例组，其中男23例，女27例，平均年龄34.8±21.3个月，所有患儿活检标本均经病理检查明确诊断为肾母细胞瘤；选取同期健康体检儿童40例作为对照组，其中男22例，女18例，平均年龄38.6±22.6个月。
纳入标准：（1）病理明确诊断为肾母细胞瘤的患儿；（2）年龄28 d至14岁；（3）无既往肿瘤发病史及其他恶性疾病；（4）手术前及采血前均未进行化疗、放疗、生物治疗等治疗；（5）均获得监护人知情同意书。
排除标准：（1）既往有肿瘤病史和有其他部位转移的肿瘤；（2）伴有严重或严重未能控制疾病者；（3）未获得监护人知情同意；（4）接受过其他研究性药物治疗。
1.2 主要试剂TRIzol试剂由美国Invitrogen公司生产；红细胞裂解液由上海索来宝生物科技有限公司生产；逆转录试剂盒及RNA提取试剂盒由美国Invitrogen公司生产；定量PCR试剂盒由美国Roche公司生产；qRT-PCR仪由美国Bio-RAD公司生产；内参照GAPDH及目的基因引物均购于上海生工生物工程有限公司。
1.3 实时荧光定量PCR检测Fra-1 mRNA表达采集两组儿童清晨空腹外周血3 mL，迅速将标本置入-80℃保存，后期经过处理，利用RNA提取试剂盒提取RNA，利用逆转录试剂盒合成cDNA备用，然后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）扩增。Fra-1上游引物：5' -AACCCTCCTCGCTTTGTGAG-3' ，下游引物：5' -GCTGGCTCTACTGTGAAGCA-3' ，片段长度182 bp；内参基因为GAPDH，上游引物：5' -TGTG-GGCATCAATGGATTTGG-3' ，下游引物：5' -ACACC-ATGTATTCCGGGTCAAT-3' ，片段长度145 bp。反应体系：2×SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA Template 2 μL，ddH2O 7.2 μL。反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性5 s，60℃退火延伸10 s，40个循环。标准品cDNA和待测样品均设置3次重复，数据处理采用2-△△Ct公式计算。
1.4 统计学分析应用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 两组儿童外周血Fra-1 mRNA水平变化实时荧光定量PCR检测结果显示，病例组患儿外周血Fra-1 mRNA相对表达量为4.7±1.5，健康对照组儿童外周血Fra-1 mRNA相对表达量为2.4±1.6，病例组Fra-1 mRNA相对表达量明显高于对照组（t=7.017，P < 0.05）。
2.2 肾母细胞瘤患儿血液Fra-1 mRNA表达水平与临床特征的关系Fra-1 mRNA表达在肾母细胞瘤的远处转移、tumor node metastasis（TNM）分期间比较差异有统计学意义（P < 0.05）；而在患者的性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤位置及不同甲胎蛋白（AFP）水平间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。
| 表 1 肾母细胞瘤患儿血液Fra-1 mRNA表达水平与临床特征的关系 |
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随访5年，50例肾母细胞瘤患儿中，45例获得随访，其中8例死亡；将持续缓解患儿纳入理想疗效组（n=33），将复发、转移或死亡的病例纳入疗效不佳组（n=12），理想疗效组Fra-1 mRNA相对表达量（3.8±1.9）低于疗效不佳组（5.3±2.2，t=2.246，P < 0.05）。
3 讨论Fra-1基因编码Fos-related antigen 1，是转录因子Fos家族成员，家族其他成员包括c-Fos、FosB和Fosl2，这些基因编码一些亮氨酸拉链蛋白，编码的蛋白可与JUN家族蛋白形成二聚体，然后形成转录因子复合物激活蛋白-1作用于机体。研究证实，Fra-1在多种恶性肿瘤中高表达, 特别是在上皮细胞生长、分化和转化中[5-7]，Fra-1有助于产生上皮-间质转化（EMT）和进一步致癌[8]。此外，其还可作为PI3K/AKT的下游靶向分子，参与调控滋养层细胞浸润和血管重建[9]，控制胚胎干细胞和滋养层细胞的分化[10]等。
目前研究显示，Fra-1通过其调节的众多转录靶标影响肿瘤细胞增殖、侵袭和转移[11]。Fra-1可通过络氨酸激酶AXL的转录上调来控制膀胱癌细胞的侵袭力[12]；通过诱导MMP的高表达从而增强骨肉瘤细胞的侵袭性[13]。EB病毒可通过ERK-Fra-1介导的MMP-9的高表达而增强鼻咽癌细胞的侵袭性[14]；升高的Fra-1与浸润性导管癌的分级增加相关[15-16]。食管鳞状细胞癌患者Fra-1表达阳性与不良预后有直接关系；同时，在食管癌的侵袭进展中Fra-1扮演着重要角色[17]。还有研究表明，Fra-1表达量的降低可以抑制结肠癌细胞的迁移、侵袭和增殖[18]，在肺癌中Fra-1表达量的上调抑制癌细胞的凋亡[19]，Fra-1表达量减少可促进癌细胞的凋亡[20]。
细胞迁移是细胞侵袭的关键步骤，肿瘤转移带来了两大挑战：估计病人肿瘤转移风险及确定治疗靶点，这早已成为当前肿瘤治疗与评估中不可或缺的一部分。本实验通过回顾性研究，利用qRT-PCR技术检测肾母细胞瘤患儿及正常体检小儿血液中Fra-1 mRNA表达情况，结果发现, 肾母细胞瘤患儿血液Fra-1 mRNA相对表达量较健康体检儿童上调，其在肾母细胞瘤的远处转移、TNM分期间差异均有统计学意义，而在患者的性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤位置及不同甲胎蛋白水平间比较差异均无统计学意义；持续缓解患儿Fra-1 mRNA表达量低于复发、转移或死亡患儿。以上结果均提示Fra-1基因可能在肾母细胞瘤的侵袭及转移中具有重要作用，并有望成为肾母细胞瘤诊断的分子标志物及临床治疗、预后评估的有效指标之一。目前Fra-1在恶性肿瘤形成、进展中的作用尚存在争议，与肾母细胞瘤的相关研究鲜有报道，其导致肾母细胞瘤发生、发展和侵袭的具体作用机制仍有待进一步深入研究。
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