新生儿持续性肺动脉高压（persistent pulmonaryhypertension of the newborn, PPHN）影响约2/1 000的活产婴儿^[1]。PPHN的典型特征是肺血管阻力逐渐增加、从右到左的肺外分流血液和出生后低氧血症^[2]。一氧化氮（NO）由内皮细胞小凹结构中的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）产生，并且NO在维持心血管稳态中起关键作用，包括血管张力、血管平滑肌细胞增殖和血管重塑的调节^[3]。本课题前期研究结果表明在低氧诱导的新生C57BL/6小鼠持续性肺动脉高压（PPH）中，钙敏感受体（CaSR）的表达量及肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓度增加，在CaSR激动剂组中增加明显，而在CaSR抑制剂组中减少^[4-5]。本研究以PPH小鼠模型为基础，分别给予CaSR激动剂和抑制剂干预，通过探讨eNOS的表达及NO浓度的变化，以期为新生儿PPH的临床诊断及治疗提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

小鼠抗大鼠eNOS单克隆抗体（美国Abcam公司），小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），CaSR激动剂氯化钆（GdCl3，美国Sigma公司），CaSR抑制剂NPS2390（德国R & D公司），eNOS反转录试剂盒、QuantiNova SYBR Green qPCR荧光定量试剂盒（美国Fermentas公司），TRIzol（美国Invitrogen公司），NO测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），小鼠脑利钠肽（BNP）ELISA试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）。

主要仪器包括低温台式离心机（美国Thermo-scientific公司），荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司），微量加样器（上海高鹤公司），病理图像分析处理系统（美国Media Cybernetics公司）等。

1.2 实验动物分组及模型建立

采用慢性缺氧的方法建立动物模型^{[4, 6]}。SPF级健康C57BL/6小鼠，体重18~25 g，由新疆维吾尔自治区实验动物研究中心提供。怀孕小鼠分娩后，将新生小鼠随机分为对照组、PPH组、激动剂组和拮抗剂组，各20只。对照组新生小鼠暴露在室内空气中，其他3组新生小鼠从出生开始暴露于氧浓度为12%的缺氧室中。激动剂和拮抗剂组小鼠每日分别通过给予GdCl₃ 16 mg/kg和NPS2390 1 mg/kg腹腔注射1次。同时，PPH组和对照组每日给予同干预组等量的生理盐水腹膜内注射。定期添加水、饲料及更换垫料，连续处理14 d。在14 d造模期间内，每日测量新生幼仔的体重。计算体重增长率（RBWI）以表示幼崽体重的变化。RBWI =（终末体重-初始体重）/初始体重×%。

1.3 标本采集

造模完成后，每组新生小鼠用水合氯醛麻醉，打开胸腔。用24-G静脉留置针进行气管插管，用10%福尔马林灌入肺部固定。取出小鼠肺及心脏组织行石蜡包埋，并通过苏木精-伊红（HE）染色观察肺组织形态。同时，取各组未行福尔马林固定的肺组织，在液氮中速冻后于-80℃储存待测。

1.4 肺泡及肺血管形态学检测

每组随机选取6张HE染色的肺组织切片以评估肺泡发育。计算肺泡平均内衬间隔（MLI）来表示肺泡平均内径，即肺泡大小^[7]。计算径向肺泡计数（RAC）来表示从终末细支气管到最近的结缔组织隔膜的肺泡隔板数量^[8]。每组每张肺组织切片中随机选取6~10个视野用于MLI及RAC测量。实验独立重复3次。

每组随机选取6张HE染色的肺组织切片以评估肺血管形态。每张肺组织切片随机选取5个视野测量直径为20~99 μm及100~150 μm的肺小动脉。肺动脉壁厚度（WT）以血管壁厚度占外径百分比表示。WT（%）= 100×（2×血管内侧壁厚度）/血管外径。同时每组随机选取6张HE染色的心脏组织切片，测量右心室与左心室厚度比（RV/LV），作为反映肺动脉高压及右心室肥大的指标。实验独立重复3次。

1.5 Western blot法检测新生小鼠肺组织eNOS蛋白表达水平

取50 mg肺组织研磨后置于冷却的蛋白裂解液和PMSF中，静止15 min，在4℃下12 000 r/min离心20 min后取上清，用BCA分析法测蛋白浓度。取50 μg蛋白样品行8%SDS-PAGE凝胶电泳，80 V 120 min将蛋白转移至PVDF膜，在室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h；加入小鼠抗大鼠eNOS一抗（1 : 1 000），小鼠抗大鼠β-actin一抗（1 : 1 000）4℃过夜；TBST洗膜3次，每次10 min；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗（1 : 20 000），常温孵育2 h，显色液显色，定影后用Image J软件分析光密度值。结果以目的蛋白与内参蛋白的比值表示。实验独立重复3次。

1.6 实时荧光定量PCR法检测新生小鼠肺组织eNOS mRNA表达水平

根据说明书，采用QuantiNova SYBR Green qPCR试剂盒检测eNOS mRNA相对表达量。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。用于实时荧光定量RT-PCR的引物序列如下：eNOS上游：5' -GTCTGCGGCGATGTCACTATGG-3' ，下游：5' -GTATGCGGCTTGTCACCTCCTG-3' 。MACT（内参）上游：5' -TTCCTTCTTGGGTATGGAAT-3' 。下游：5' -GAGCAATGATCTTGATCTTC-3' 。

使用TRIzol提取新生小鼠肺组织匀浆总RNA，取5 μL进行逆转录操作合成20 μL的cDNA。反应体系：cDNA 3 μL、SYBR Green I 10 μL、上下游引物各1 μL、无酶水5 μL。反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，60℃退火20 s，共运行40个循环。以eNOS PCR产物与MACT内参的荧光密度比值作为eNOS mRNA的相对表达含量，表达的相对定量结果以2^-△△CT表示。实验独立重复3次。

1.7 ELISA法检测新生小鼠肺组织匀浆BNP及NO浓度

取50 mg肺组织加入适量生理盐水研磨后，置于4℃下3 000 r/min离心20 min，取上清，根据试剂盒说明书，使用小鼠BNP ELISA试剂盒和NO检测试剂盒检测上清液中BNP和NO的水平，通过450nm波长下测定吸光度（OD值）来计算新生小鼠肺组织匀浆中BNP和NO的浓度。实验独立重复3次。

1.8 免疫组化法检测新生小鼠肺组织eNOS表达

肺组织用酒精脱水后包埋于石蜡中。将肺组织切片脱蜡处理后，经3%过氧化氢处理，并用枸橼酸抗原热修复，室温冷却后PBS冲洗3次，加入小鼠抗大鼠单克隆eNOS抗体（1 : 500），4℃孵育过夜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗（1 : 1 000），加入DAB显色液，中性树胶封片后晾干，置于镜下观察。

1.9 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 新生小鼠一般状况

四组新生小鼠的体重和RBWI如表 1所示。PPH组和激动剂组的新生小鼠生长缓慢、反应迟钝、精神相对较差，但死亡率并没有增加。与对照组相比较，PPH组和激动剂组的体重和RBWI显著降低（P < 0.05），而抑制剂组小鼠的体重和RBWI并无明显差别（P < 0.05）。

2.2 各组小鼠肺组织中肺泡形态、大小及肺泡隔板变化

HE染色肺组织切片结果显示：与对照组相比较，PPH组小鼠的肺泡变大，肺泡隔板减少；MLI值增加，RAC值减小（P < 0.05）；提示缺氧对肺泡发育有抑制作用。同时，激动剂组的肺泡形态、MLI值、RAC值与PPH组相似，说明CaSR激动剂并没有加重缺氧诱导的肺泡抑制作用。抑制剂组较PPH组肺泡破坏程度有所缓解；MLI值小于PPH组但仍大于对照组，而RAC值大于PPH组但仍小于对照组（P < 0.05）；说明在低氧条件下，CaSR抑制剂能改善的肺泡发育，增加肺泡隔板数量，但不能完全恢复。见图 1，表 2。

2.3 各组小鼠肺小动脉血管壁、右心室厚度及BNP浓度变化

观察各组肺组织HE染色切片，与对照组比较，PPH组和激动剂组小鼠肺小动脉在低氧条件下管壁明显增厚，而抑制剂组小鼠肺小动脉管壁厚度减小，与对照组无明显差异（图 2）。同时，PPH组和激动剂组WT%值均较对照组显著增加（P < 0.05），但激动剂组与PPH组相比差异无统计学意义（P < 0.05）；抑制剂组较PPH组WT%值明显降低（P < 0.05）。本实验通过检测BNP浓度反映肺动脉压^[9]。PPH组和激动剂组中的BNP浓度较对照组显著增加（P < 0.05），说明PPH组和激动剂组小鼠存在明显的肺动脉高压和肺血管重塑；抑制剂组中BNP浓度较PPH组和激动剂组明显降低，但仍高于对照组（P < 0.05），说明抑制剂组小鼠肺动脉高压和肺血管重塑有所改善，但不能完全恢复。与对照组相比较，PPH组小鼠的RV/LV值显著增加（P < 0.05），说明存在右心室肥大；激动剂组和拮抗剂组RV/LV值较PPH组有所降低，但差异无统计学意义（P < 0.05）。见表 3。

2.4 新生小鼠肺组织中eNOS蛋白及其mRNA相对表达量及肺组织匀浆中NO浓度变化

通过Western blot及qRT-PCR检测eNOS的蛋白表达及其mRNA水平，结果显示PPH组eNOS蛋白及其mRNA表达量较对照组明显增加，激动剂组进一步增强eNOS的蛋白及其mRNA表达量（P < 0.05）；而抑制剂组与激动剂组相比，eNOS蛋白及其mRNA表达量有所降低，但仍然高于对照组（P < 0.05）。与对照组相比，PPH组中NO浓度升高，激动剂组NO浓度进一步升高（P < 0.05）；抑制剂组NO浓度较PPH组有所降低，但仍高于对照组（P < 0.05）。见图 3，表 4。

2.5 新生小鼠肺组织中eNOS的表达

免疫组织化学分析结果表明，eNOS蛋白主要在肺小动脉内皮细胞和平滑肌细胞中表达。与对照组相比，PPH组的肺动脉中表达eNOS的内皮细胞和平滑肌细胞的数量增加（黄色），激动剂组增加更加明显（褐色），而eNOS在抑制剂组中表达有所下降。见图 4。

3 讨论

本研究通过14 d低氧诱导C57BL/6新生小鼠以建立PPH动物模型，观察CaSR激动剂和抑制剂对模型小鼠eNOS及NO浓度的影响。研究结果显示：与对照组比较，PPH组小鼠肺小动脉管壁厚度、右心室游离壁厚度及肺组织匀浆中BNP浓度均明显增加，这说明PPH新生小鼠模型建立成功。有研究表明，多数患有PPHN的新生儿在出生不久后便会死亡，这与肺血管系统重塑相关^[10]。慢性缺氧被认为会导致肺小动脉中膜层平滑肌细胞异常增殖；同时，慢性缺氧也是引起PPHN和加重病理生理状况的重要因素之一。

eNOS是一种多结构域酶，由含有血红素、L-精氨酸、辅因子四氢生物蝶呤和还原酶等结合位点的N末端加氧酶结构域组成。eNOS通过使NADPH衍生的电子传递到位于还原酶结构域的黄素中，然后转移到位于加氧酶结构域中的血红素中，使得血红素铁可以结合O₂并通过催化L-精氨酸逐步合成NO^[11]。血管内皮细胞释放多种活性物质，其中NO在心血管稳态及血管内皮功能的调节中发挥关键作用，包括局部血管平滑肌张力的调节、血管平滑肌细胞的增殖、动脉粥样硬化和血管重塑的调节^{[3, 12]}。

有研究显示，在慢性阻塞性肺病、心肺转流和充血性心力衰竭引起的肺动脉高压中观察到NO释放减少，并且NO产生减少可能会导致肺动脉高压的发生^[13]。本研究结果显示：通过免疫组化染色，eNOS主要在肺小动脉内皮细胞和平滑肌细胞中表达。同时结合Western blot和qRT-PCR结果说明：与对照组相比，PPH组新生C57BL/6小鼠肺动脉中eNOS的表达增加，新生小鼠肺组织匀浆中NO浓度升高。该结果与eNOS蛋白表达在肺动脉高压患者中有一定程度的上调^[14]及缺氧诱导的肺动脉高压大鼠的肺组织匀浆中eNOS酶活性增加等研究报道相一致。同时，GdCl₃（CaSR激动剂）能够进一步上调eNOS表达和升高NO浓度；而NPS2390（CaSR抑制剂）能下调其表达和降低NO浓度。其可能的原因是，eNOS上存在Ca²⁺/钙调蛋白（CaM）结合的生物活性结构，并且eNOS的活性由细胞内Ca²⁺浓度和CaM结合所决定^[11]。本课题组前期研究表明，在低氧诱导的新生C57BL/6小鼠PPH中，肺动脉中CaSR的表达量及肺动脉平滑肌细胞内Ca²⁺浓度增加，在CaSR激动剂组中增加明显，而在CaSR抑制剂组中减少^[4-5]。说明在缺氧环境中，肺动脉CaSR表达量增加，同时引起细胞内Ca²⁺浓度也随之增高，增多的Ca²⁺与eNOS活性结构上的CaM相结合从而上调eNOS的活性和其表达，进而导致NO浓度增加。进一步激动CaSR能增加eNOS在肺动脉上的表达和活性，并升高NO的浓度，而抑制CaSR能减少这种作用。NO是一种氧自由基性质的分子。生理情况下，由一氧化氮合酶合成的NO可以使得血管平滑肌舒张从而降低血压。但有报道显示，在低氧环境条件下，NO增加过多，并与氧自由基合成过氧亚硝酸盐，发挥细胞毒性作用，引起肺血管内皮损伤，进而导致肺动脉高压的发展^[15-16]。本研究结果提示，CaSR可能通过调节Ca²⁺浓度而影响eNOS和NO的表达，并参与PPH的发病。其具体机制及信号通路有待于课题组进一步研究及探讨。

综上所述，新生小鼠肺动脉中有eNOS的表达，低氧可使eNOS表达和NO浓度增高，激动CaSR可进一步增加eNOS的表达及升高NO浓度，同时NO大量释放可致使肺血管内皮损伤，最终导致PPH的发生。CaSR抑制剂降低eNOS的表达及NO浓度，从而在一定程度上减轻PPH中肺血管损伤并逆转血管构型重建。