2019, Vol. 21
2. 云南省第一人民医院遗传诊断中心, 云南 昆明 650032;
3. 云南省第二人民医院神经内科, 云南 昆明 650021;
4. 云南省第一人民医院儿科, 云南 昆明 650032
脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy, SMA）是一类由脊髓前角运动神经元变性导致肌无力、肌萎缩的常染色体隐性遗传病。其共同特点是脊髓前角细胞变性，临床表现为进行性、对称性、肢体近端为主的广泛性弛缓性麻痹与肌萎缩，智力发育及感觉均正常。SMA在活产婴儿中的发生率是1/6 000~1/10 000，人群携带率在1/40~1/60之间[1]。据报道，中国人中SMA携带者频率大概为1/42~1/52[2-3]。根据发病年龄、肌无力严重程度和达到的运动功能，SMA可分为4种常见临床类型，分别为SMA-Ⅰ型、SMA-Ⅱ型、SMA-Ⅲ型和SMA-Ⅳ型，即婴儿型、中间型、少年型和成年型[4-5]。
SMA的主要致病基因为运动神经元存活基因1（survival motor neuron 1, SMN1），定位于5q11.2-q13.3，约95%的Ⅰ~Ⅲ型SMA患者存在着SMN1基因第7外显子的纯合缺失，且大部分是外显子7、8同时缺失，只有少部分仅缺失外显子7[6]。位于着丝粒侧的SMN2基因与端粒侧SMN1基因具有高度同源性，仅在各自的3'端有5个单核苷酸的差别[2]。SMN2基因的缺失虽不致病，但其是SMN1基因的修饰基因，在SMN1基因缺失的情况下起着剂量补偿作用，SMN2拷贝数与SMA表型严重程度相关[7]。目前该病的一般治疗手段包括预防肺部感染、改善通气状况和脊柱侧凸外科矫形手术等，特别是发生呼吸窘迫后无创通气成为延长患儿寿命的重要手段[8]。受云南省经济和医疗发展水平的客观限制，很多患儿家庭没有条件选择夜间无创辅助通气设备来改善患儿呼吸状况，治疗手段相对单一，患儿的疾病进展更接近SMA的自然进程，更有利于客观分析SMN2拷贝数同临床表型的关系。
本研究中，我们通过分析SMA患儿临床表型，同时检测SMN基因拷贝数，探讨本地不同临床分型SMA患儿的临床特点和SMN拷贝数特点，为SMA临床分型、治疗策略、预后评估和遗传咨询提供参考依据。
1 资料与方法 1.1 研究对象选取2013年1月至2017年12月在云南省第一人民医院儿科、遗传诊断中心和云南省第二人民医院神经内科就诊的SMA患儿共45例。其诊断符合1992年国际SMA协会定义的诊断标准及分型标准[9]。选取既往保存的50例无SMA家族史的健康儿童样本作为对照，其中男25例，女25例，年龄范围5~12岁，中位年龄为7岁5个月。本研究遵循的程序符合本院医学伦理审查委员会所制定的伦理学标准，得到该委员会批准（2014YXLH055），征得受试对象本人的知情同意，并与之签署临床研究知情同意书。
1.2 试剂与仪器QIAamp DNA Blood Mini基因组DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司），ABI 2720PCR扩增仪（美国ABI公司），SALSA MLPA probemix P021-A2 SMA试剂盒（荷兰MRC-Holland公司），ABI-3130 Genetic Analyzer（美国ABI公司），POP4凝胶（美国ABI公司），引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
1.3 基因组DNA的提取抽取受检者静脉血2 mL，EDTA-K2抗凝。用QIAamp DNA Blood Mini试剂提取基因组DNA，紫外分光光度计测定DNA浓度，用灭菌双蒸水调整DNA浓度为100 ng/µL，-20℃保存。
1.4 多重连接依赖性探针扩增技术检测分析采用多重连接依赖性探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA）进行检测，严格按照SALSA MLPA probemix P021-A2 SMA试剂盒（MRC-Holland）说明操作。Coffalyser.NET软件（MRC-Holland, www.mlpa.com-MLPA）分析实验结果。
1.5 患儿生存状况随访通过门诊随访观察的方式对患儿生存状况进行追踪，内容包括生长发育状况，坐、站、行走等运动功能，肌张力，肌肉萎缩，步态异常，呼吸状况，死亡时年龄等。
1.6 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行数据处理。非正态分布计量资料用中位数和四分位数间距[M（P25，P75）]表示，计数资料以例数和百分率（%）表示，组间比较采用Fisher精确检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 45例SMA患儿临床特征分析45例SMA患儿中，男24例，女21例，男女之比1.1 : 1，总的发病年龄为12.0（7.0，18.0）个月。以肌无力为首发症状就诊者占比最高，为58%（26/45）；其次为呼吸窘迫，占16%（7/45）；最后为步态异常和生长发育迟缓，各占13%（6/45）。见表 1。
| 表 1 SMA患儿的临床特征[例（%）或M（P25，P75）] |
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45例SMA患儿经MLPA检测，发现SMN1第7和8外显子纯合缺失者为42例，占93%（42/45）；仅有第7外显子缺失者为3例，占7%（3/45）。SMA不同临床分型和SMN1基因第7、8外显子缺失类型间无相关性（P=0.56）。见表 2。
| 表 2 SMN1基因第7和8外显子缺失类型结果 |
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50例健康儿童的SMN基因中，SMN1基因均为2拷贝，SMN2基因可见0、1、2和3拷贝，未检出SMN2基因4拷贝者。45例SMA患儿和50例健康儿童的SMN2基因拷贝数分布差异有统计学意义（P < 0.001），前者以2和3拷贝者居多，后者以1和2拷贝者居多。见表 3。
| 表 3 SMA患儿和健康儿童SMN2拷贝数分布情况比较[例（%）] |
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SMN2基因拷贝数在SMA不同临床分型间的分布存在显著性差异（P=0.04），Ⅰ型SMA患儿的SMN2拷贝数以2或3拷贝者居多，Ⅱ型以3拷贝者居多，Ⅲ型以3或4拷贝者居多。从临床结局来看，SMN2为2拷贝者死亡6例，占55%（6/11），存活者基本丧失行动能力；SMN2为3拷贝者死亡2例，占8%（2/26），出现呼吸窘迫者5例，占19%（5/26），仅有4例保留独立行走能力，占15%（4/26）；SMN2为4拷贝者，无死亡和呼吸窘迫病例，仍保留独立行走能力者占38%（3/8）。患儿SMN2基因拷贝数同临床结局间的关系存在显著性差异（P=0.009）。见表 4。
| 表 4 SMN2拷贝数同患儿临床分型及预后之间的关系[例（%）或M（P25，P75）] |
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在遗传性疾病中，SMA是婴幼儿较常见的死因。2016年12月美国食品药品管理局（FDA）批准Nusinersen注射液上市用于治疗儿童和成人SMA，其安全性和有效性也得到证实[10-11]。但由于该药国内尚未获批上市且治疗费用昂贵，短期内还不能让所有患者受益。SMA的治疗仍限于为患者提供呼吸支持和其它物理治疗手段，重型SMA患者最终死于呼吸肌瘫痪或全身功能衰竭，而这些依然是当前经济欠发达地区患儿群体需要面临的问题。对SMA患儿进行分型和预后判断，对于指导患儿家庭选择治疗方案，客观预测疾病结局具有重要意义。
SMA是由SMN基因功能异常引起的，SMN1基因是其主要致病基因。本研究中，我们利用MLPA技术对45例SMA患儿进行SMN1基因缺失分析，检出SMN1第7和第8外显子同时缺失者占93%，另7%仅第7外显子缺失，SMA不同临床分型和SMN1基因第7、8外显子缺失类型间无相关性，该结论同多数学者报道结果一致[12-14]。
在健康人群中SMN2拷贝数的变化是从0至4，但各型SMA患者至少有1个拷贝的SMN2基因，因为SMN基因全部丢失会导致早期胚胎死亡[15]。SMA患儿和健康儿童的SMN2基因拷贝数分布差异有统计学意义，SMA患儿中SMN2拷贝数为2或3的比例较高，而健康儿童的SMN2拷贝数则以1或2的比例较高，这一发现同Fang[13]和Qu[16]报道结果一致，进一步说明SMN1向SMN2基因转换可能是SMA患儿生存的一种自我保护途径[2, 8, 13, 17]。此外，SMN2基因是对SMA疾病进展有影响的诸多重要修饰基因之一，SMN2基因产生10%全长转录产物，基因拷贝数越多，产生全长转录产物也增多，可部分补偿SMN蛋白的不足，减轻SMA表型严重程度，也可预测SMA急性或慢性病程[16]。大部分SMA Ⅰ型有2个拷贝，Ⅱ型通常有3个拷贝，Ⅲ型通常有3或4个拷贝[17-19]，与本研究结果相符。本研究中SMA Ⅰ型患儿携带3拷贝SMN2者亦较高，为40%，可能和本组患儿发病年龄相对较晚，期望寿命较长有关。本研究对45例SMA患儿进行随访后发现，11例SMN2为2拷贝者有6例死亡，占55%（6/11），而8例SMN2为4拷贝者没有出现死亡和呼吸窘迫病例，仍保留独立行走能力者占38%（3/8）。患儿SMN2基因拷贝数同临床结局间的关系存在显著性差异。上述结果再次说明，SMN2拷贝数同疾病分型有密切的关系，SMN2拷贝数越多，临床分型相对较轻，疾病预后较好。
综上所述，SMN1基因第7外显子缺失造成SMA表型，但与疾病分型和严重程度无关，SMN2拷贝数可以用于预测SMA患儿疾病严重程度。对SMA患儿进行临床表型和SMN基因拷贝数特点进行分析，将有助于本地区SMA患儿的早期诊断、辅助治疗和遗传咨询，特别是对预防先证者家庭再次生育SMA患儿具有重要意义。
受实验条件的客观限制，我们没有对除SMN2以外的修饰基因进行研究，虽然SMN2拷贝数可以用于预测SMA患儿疾病严重程度，但影响SMA疾病严重程度和预后的因素还有很多。有文献报道，极少数SMN2拷贝为3或4的SMN1纯合缺失者没有任何临床表现[20]，这进一步说明SMN2基因绝非是SMA的唯一修饰基因。除了在SMN1基因附近还存在若干个具有修饰SMA表型的作用的基因外[12-13, 16, 21]，近年来关于PLS3、CORO1C和NCALD基因对SMA严重程度的影响逐渐得到体内或体外实验证实。通过上调PLS3和CORO1C基因的表达，抑制NCALD基因的表达，可以修复因为SMN基因缺陷而损伤的细胞内吞作用，重建神经突触功能，进而影响SMA预后[22-25]。发现并阐明这些修饰基因的功能，为今后SMA的治疗提供了潜在的手段。我们在分析SMA患儿表型，预测患儿预后，提供产前诊断咨询服务时也应该充分考虑这些修饰基因的共同作用。
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