2019, Vol. 21
2. 中南大学湘雅医院儿科, 湖南 长沙 410008;
3. 湖南省儿童医院血液内科, 湖南 长沙 410007;
4. 中南大学湘雅二医院儿科, 湖南 长沙 410011
幼年型粒单核细胞白血病（juvenile myelomonocytic leukemia, JMML）是一种罕见的造血系统恶性疾病，以粒系及单核系异常增生及脏器浸润为主要特征，伴有红系及巨核系细胞发育异常，兼有骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes, MDS）和骨髓增殖性疾病的特征[1]。JMML在0~14岁儿童的发病率约为1.2/106，占儿童白血病的2%~3%，60%在2岁以内发病，男性多于女性[2]。JMML的发病机制为Ras信号通路中调控细胞增殖和凋亡的相关基因突变，导致髓样祖细胞对粒-巨噬细胞集落刺激因子高度敏感，从而激活Ras蛋白，活化的Ras-GTP结合Raf-1引发丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶级联反应，最终激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路、导致肿瘤发生[3-6]。而根据Ras通路上游基因突变的发生位点，探索靶向药物进行基因调控，将是JMML重要的研究方向。本研究收集湖南省多中心的15例JMML病例，总结分析其临床及基因学特点，探讨基因型与预后的关系。
1 资料与方法 1.1 研究对象收集2014年1月至2018年1月期间湖南省人民医院、中南大学湘雅医院、湖南省儿童医院及中南大学湘雅二医院临床诊断的15例JMML患儿的临床资料，包括年龄、性别、重要症状体征，以及血常规、血红蛋白F（HbF）、外周血涂片、骨髓细胞学、染色体、BCR/ABL融合基因和治疗结局等。JMML诊断符合2016年WHO制定的JMML诊断标准[7]。15例JMML患儿中男13例、女2例，男女比例为6.5 : 1。发病年龄为19（2~67）个月，11例（73%）患儿4岁以内发病。
最长随访至2018年5月30日, 随访时间为18（1~48）个月。
1.2 二代测序检测JMML突变基因所有病例均采集骨髓或外周血6~8 mL（EDTA抗凝），4℃保存，72 h内进行DNA提取。采用二代测序（Ion PGM测序仪进行）检测PTPN11、CBL、NF1、NRAS、KRAS基因。通过Coverage Analysis软件与Variant Caller插件进行基因序列比对及突变点的报出。
1.3 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行数据处理。计量资料用中位数及范围表示，计数资料用构成比（%）表示，年龄、HbF水平与生存时间的相关性选用Spearman相关性检验。P < 0.05示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 症状特点以腹胀、发热、出血、面色苍白为首发症状的分别为7例（47%）、5例（33%）、2例（13%）、1例（7%）。所有患儿均有肝脾肿大（重度脾肿大6例，占40%）和浅表淋巴结肿大（直径0.5~4 cm），4例（27%）患儿有皮肤出血点及红疹，2例（13%）患儿有牛奶咖啡斑。
2.2 实验室检查的特点15例JMML患儿初诊时均有不同程度贫血：重度贫血1例（7%），中度贫血7例（47%），轻度贫血7例（47%）。初诊时白细胞升高发生率为93%（14/15）、血小板减少发生率67%（10/15）。白细胞计数为38.70（7.76~74.55）×109/L（参考值：3.69~9.16×109/L）；血小板计数为30（8~229）×109/L（参考值：101~320×109/L）。15例患儿初诊时外周血单核细胞均 > 1.0×109/L，单核细胞计数为6.54（1.31~23.96）×109/L（参考值：0.16~1×109/L）。
15例患儿外周血涂片幼稚细胞比例在1%~7%。所有患儿的骨髓细胞呈增生活跃至极度活跃，原始细胞+幼稚细胞比例均 < 20%，原始单核+幼稚单核细胞的比例为1%~10%。
10例（67%）患儿的HbF高于相应年龄正常值，最高62.5%。
2.3 染色体核型及基因检测结果15例患儿均为正常核型，均未见Ph染色体，其中1例为7号染色体缺失。
15例患儿BCR/ABL融合基因检测均阴性。检测到PTPN11或NF1或CBL或RAS基因突变，以PTPN11基因突变检出率最高（5例，33%），其次为NF1基因突变（4例，27%），CBL基因突变和RAS基因突变（各3例，均占20%）。病例5、6、9、12、14检测到PTPN11基因突变，PTPN11基因突变的位点主要位于Exon 3、13。病例9经对症支持治疗后为求造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）复查基因时检测到ASXL1基因杂合移码突变。病例1、2、10检测到CBL基因突变，突变位点主要在Exon 8和经典剪切位点。病例3患儿检测到NF1和SETBP1基因突变，病例4、7、11检测到NF1基因突变，NF1基因突变位点位于在Exon 4、10、22、23、30。病例8检测到KRAS基因突变，病例13、15为NRAS基因突变，突变位点均发生在Exon 2。见表 1。
| 表 1 15例JMML患儿的基因突变情况及治疗结局 |
|
随访时间18（1~48）个月。15例中死亡8例（病死率为53%），存活7例。见表 1~2。
| 表 2 基因突变类型与生存结局的关系 |
|
|
JMML诊断时年龄与生存期无相关性（rs=-0.45、P=0.089）。HbF水平与生存期呈负相关（rs=-7.21、P=0.002）。
5例存在PTPN11基因突变的患儿中4例死亡，其中1例于确诊后1个月死亡，该患儿予顺式维A酸（每日100 mg/m2）及巯嘌呤（每日50 mg/m2）化疗；其余3例仅予对症支持治疗；病例9确诊1个月后骨髓细胞学检查提示转变为急性髓系白血病（M5），按急性髓系白血病予以4轮化疗（FLAG+HAE+MidAC）后再予DNA甲基化转移酶抑制剂（地西他滨每日20 mg /m2，连续5 d）桥接HSCT治疗，移植后1年仍存活、骨髓持续缓解。CBL突变患儿3例，其中1例予羟基脲治疗，其余2例仅予对症支持治疗，随访至截止日期均存活，最长生存时间31个月，且其中1例血液学改善、肝脾明显缩小。4例存在NF1突变（2例存在牛奶咖啡斑，伴有1型神经纤维瘤表现）的患儿（均仅予对症支持治疗）中死亡3例，另1例随访至截止日期仍存活。RAS突变的3例患儿（均未予化疗）中1例KRAS突变患儿确诊后22个月死亡，2例NRAS突变患儿尚存活，最长生存时间48个月。
3 讨论近年来，儿童恶性肿瘤的发病率呈升高趋势，也是儿童最主要的死亡原因之一，仅次于儿童意外死亡[8]。中国儿童恶性肿瘤发病率为6.9/10万，其中血液肿瘤发病率为5.68/10万[9-10]，而JMML发病率约为1.2/100万[2]。本组资料统计近4年来湖南地区JMML共15例，估算其发病率约0.3/100万，低于文献报道，可能与本病诊断困难有关。分析15例JMML患儿临床资料，提示当患者尤其是婴幼儿出现发热及肝脾肿大，并有白细胞升高、外周血单核细胞 > 1×109/L及HbF升高，但骨髓原始+幼稚细胞 < 20%，在排除MDS、溶血性贫血、噬血细胞综合征、Wiskott-Aldrich综合征等疾病后，应考虑JMML可能，并尽快完善PTPN11、CBL、NF1、NRAS和KRAS突变基因检测以明确诊断。
杨文钰等[11]分析了14例JMML患儿的临床特点，在8例患儿中检测到4种基因突变，并进行预后分析，但未检测到CBL基因突变。本研究多中心15例病例均检测到突变基因，通过分析其临床特点，部分实验室结果如HbF水平与预后的相关性及5种基因型与预后的关系，为JMML的分层治疗及基因靶向治疗提供依据。90%的JMML患者中存在PTPN11、CBL、NF1、NRAS、KRAS基因突变[12]。本研究检测到5例（33%）PTPN11基因突变，4例（27%）NF1基因突变，3例（20%）CBL基因突变，2例（13%）NRAS基因突变及1例（7%）KRAS基因突变。PTPN11编码Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶（SHP-2），其分子内结构因存在相互抑制而失去催化活性，发生基因突变时（突变点主要位于Exon 3和13）自身抑制消除，从而促进Ras通路的过度活化[13-14]。Tartaglia等[15]研究表明存在PTPN11基因突变的JMML患儿生存期短，转变为AML的风险高。本研究死亡的8例中4例具有PTPN11基因突变，与文献相符。
Sakaguchi等[16]报道JMML患儿可检测到BMP4、CDKN2B、CALCA和RARB基因的超甲基化，具有超甲基化的JMML患儿的5年总生存期较低。而Locatelli等[2]发现具有PTPN11基因突变的病例多存在超甲基化，存在CBL基因突变的病例则没有或甲基化程度低，因此具有PTPN11基因突变的JMML患儿预后较差。本研究检测到PTPN11基因突变的5例患儿中4例死亡，CBL基因突变的3例中无死亡者。因此，DNA异常甲基化是JMML独立的预后不良因素之一，对于异常甲基化评分增高患者，DNA甲基化转移酶抑制剂和新型分子靶向药物将是重要的治疗策略。对比早年国际报道[17]的对JMML患者单独行HSCT 50%的治愈率而言，Flotho等[18]提出予以地西他滨+中等强度化疗桥接HSCT，将提高其治愈率、降低复发率。因此，JMML患儿完善BMP4、CDKN2B、CALCA和RARB基因的DNA甲基化检测，对于DNA甲基化转移酶抑制剂等靶向治疗的应用具有指导意义。
本研究存在CBL及NRAS基因突变的患儿均存活。多位学者[19-22]报道具有CBL及NRAS基因突变的JMML患者进展相对缓慢或临床症状可自发改善。本研究在1例NF1基因突变的患儿中还检测到SETBP1基因突变，该患儿确诊12个月后死亡。Sakaguchi等[23]、Stieglitz等[24]发现约15%的JMML患儿继发SETBP1和JAK3基因突变，这两种继发体细胞突变与患儿的不良预后有关。
JMML的治疗仍是世界一大难题，未接受HSCT患儿的中位生存间是10~12个月，HSCT仍然是目前JMML唯一的根治方法，能够使超过50%的患者治愈[17]。本研究行HSCT治疗的1例患儿确诊后18个月仍存活。随着JMML分子遗传学及表观遗传学研究的深入，靶向治疗也日益受到关注。有研究[18, 25]将DNA甲基化转移酶抑制剂用于JMML患儿治疗取得了理想效果。Ras信号通路也可能作为JMML治疗的靶点。有研究表明雷帕霉素[26]通过抑制Ser/Thr蛋白激酶从而阻止Ras信号通路过度活化，曲贝替定[27]通过下调RhoGTP酶从而发挥抑制肿瘤的作用，该类新型靶向药物均对JMML有一定效果，MEK抑制剂对JMML疗效的Ⅱ期临床试验[28]也正在进行。
综上所述，JMML的自然预后不良，患儿预后与基因突变类型相关，JMML患儿根据临床特点及分子遗传学特征进行分层诊治，对于存在PTPN11、KRAS、NF1基因突变的高危患儿尽早进行去甲基化治疗桥接HSCT可望改善预后。
| [1] |
Yoshimi A, Kojima S, Hirano N. Juvenile myelomonocytic leukemia:epidemiology, etiopathogenesis, diagnosis, and management considerations[J]. Paediatric Drugs, 2010, 12(1): 11-21. (  0) |
| [2] |
Locatelli F, Niemeyer CM. How I treat juvenile myelomonocytic leukemia[J]. Blood, 2015, 125(7): 1083-1090. DOI:10.1182/blood-2014-08-550483 ( 0) |
| [3] |
Lachenaud J, Strullu M, Baruchel A, et al. Juvenile myelomonocytic leukemias[J]. Bull Cancer, 2014, 101(3): 302-313. ( 0) |
| [4] |
Maertens O, Cichowski K. An expanding role for RAS GTPase activating proteins (RAS GAPs) in cancer[J]. Adv Biol Regul, 2014, 55: 1-14. DOI:10.1016/j.jbior.2014.04.002 ( 0) |
| [5] |
Lipka DB, Witte T, Toth R, et al. RAS-pathway mutation patterns define epigenetic subclasses in juvenile myelomonocytic leukemia[J]. Nat Commun, 2017, 8(1): 2126. DOI:10.1038/s41467-017-02177-w ( 0) |
| [6] |
Loh ML. Recent advances in the pathogenesis and treatment of juvenile myelomonocytic leukaemia[J]. Br J Haematol, 2011, 152(6): 677-687. DOI:10.1111/bjh.2011.152.issue-6 ( 0) |
| [7] |
Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia[J]. Blood, 2016, 127(20): 2391-2405. DOI:10.1182/blood-2016-03-643544 ( 0) |
| [8] |
梁迪, 张亚琛, 李道娟, 等. 河北省儿童恶性肿瘤发病与死亡现状及趋势分析[J]. 肿瘤预防与治疗, 2017, 30(3): 198-202. DOI:10.3969/j.issn.1674-0904.2017.03.009 ( 0) |
| [9] |
陈万青, 孙可欣, 郑荣寿, 等. 2014年中国分地区恶性肿瘤发病和死亡分析[J]. 中国肿瘤, 2018, 27(1): 1-14. ( 0) |
| [10] |
周艳玲, 安嘉璐, 田玲. 我国儿童恶性肿瘤的流行病学分析[J]. 中国当代儿科杂志, 2015, 17(7): 649-654. ( 0) |
| [11] |
杨文珏, 陈晓娟, 王书春, 等. 儿童幼年型粒单核细胞白血病突变基因型与临床特征分析[J]. 中国当代儿科杂志, 2015, 17(1): 1-5. ( 0) |
| [12] |
Chang TY, Dvorak CC, Loh ML. Bedside to bench in juvenile myelomonocytic leukemia:insights into leukemogenesis from a rare pediatric leukemia[J]. Blood, 2014, 124(16): 2487-2497. DOI:10.1182/blood-2014-03-300319 ( 0) |
| [13] |
Loh ML, Vattikuti S, Schubbert S, et al. Mutations in PTPN11 implicate the SHP-2 phosphatase in leukemogenesis[J]. Blood, 2004, 103(6): 2325-2331. DOI:10.1182/blood-2003-09-3287 ( 0) |
| [14] |
Tartaglia M, Mehler EL, Goldberg R, et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome[J]. Nat Genet, 2001, 29(4): 465-468. DOI:10.1038/ng772 ( 0) |
| [15] |
Tartaglia M, Niemeyer CM, Fragale A, et al. Somatic mutations in PTPN11 in juvenile myelomonocytic leukemia, myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia[J]. Nat Genet, 2003, 34(2): 148-150. DOI:10.1038/ng1156 ( 0) |
| [16] |
Sakaguchi H, Muramatsu H, Okuno Y, et al. Aberrant DNA methylation is associated with a poor outcome in juvenile myelomonocytic leukemia[J]. PLoS One, 2015, 10(12): e0145394. DOI:10.1371/journal.pone.0145394 ( 0) |
| [17] |
Locatelli F, Nöllke P, Zecca M, et al. Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) in children with juvenile myelomonocytic leukemia (JMML):results of the EWOGMDS/EBMT trial[J]. Blood, 2005, 105(1): 410-419. DOI:10.1182/blood-2004-05-1944 ( 0) |
| [18] |
Flotho C, Sommer S, Lübbert M. DNA-hypomethylating agents as epigenetic therapy before and after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in myelodysplastic syndromes and juvenile myelomonocytic leukemia[J]. Semin Cancer Biol, 2018, 51(8): 68-79. ( 0) |
| [19] |
Niemeyer CM, Kang MW, Shin DH, et al. Germline CBL mutations cause developmental abnormalities and predispose to juvenile myelomonocytic leukemia[J]. Nat Genet, 2010, 42(9): 794-800. DOI:10.1038/ng.641 ( 0) |
| [20] |
Doisaki S, Muramatsu H, Shimada A, et al. Somatic mosaicism for oncogenic NRAS mutations in juvenile myelomonocytic leukemia[J]. Blood, 2012, 120(7): 1485-1488. DOI:10.1182/blood-2012-02-406090 ( 0) |
| [21] |
Caye A, Strullu M, Guidez F, et al. Juvenile myelomonocytic leukemia displays mutations in components of the RAS pathway and the PRC2 network[J]. Nat Genet, 2015, 47(11): 1334-1340. DOI:10.1038/ng.3420 ( 0) |
| [22] |
Stieglitz E, Taylor-Weiner AN, Chang TY, et al. The genomic landscape of juvenile myelomonocytic leukemia[J]. Nat Genet, 2015, 47(11): 1326-1333. DOI:10.1038/ng.3400 ( 0) |
| [23] |
Sakaguchi H, Okuno Y, Muramatsu H, et al. Exome sequencing identifies secondary mutations of SETBP1 and JAK3 in juvenile myelomonocytic leukemia[J]. Nat Genet, 2013, 45(8): 937-941. DOI:10.1038/ng.2698 ( 0) |
| [24] |
Stieglitz E, Troup CB, Gelston LC, et al. Subclonal mutations in SETBP1 confer a poor prognosis in juvenile myelomonocytic leukemia[J]. Blood, 2015, 125(3): 516-524. DOI:10.1182/blood-2014-09-601690 ( 0) |
| [25] |
林宇辰, 彭智勇, 杨秀玲, 等. 幼年型粒单核细胞白血病的研究进展[J]. 国际输血及血液学杂志, 2017, 40(5): 418-421. DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-419X.2017.05.009 ( 0) |
| [26] |
Upadhyay SY, De Oliveira SN, Moore TB. Use of rapamycin in a patient with juvenile myelomonocytic leukemia:a case report[J]. J Investig Med High Impact Case Rep, 2017, 5(3): 2324709617728528. ( 0) |
| [27] |
Romano M, Della Porta MG, Gallì A, et al. Antitumour activity of trabectedin in myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms[J]. Br J Cancer, 2017, 116(3): 335-343. DOI:10.1038/bjc.2016.424 ( 0) |
| [28] |
Locatelli F, Algeri M, Merli P. Novel approaches to diagnosis and treatment of juvenile myelomonocytic leukemia[J]. Expert Rev Hematol, 2018, 11(2): 129-143. DOI:10.1080/17474086.2018.1421937 ( 0) |