2019, Vol. 21
急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）是儿童时期最常见的恶性肿瘤，5年无病生存率（event-free survival, EFS）达到80%以上[1-2]，但仍有部分患儿化疗不缓解或复发，即使采用嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor T-Cell immunotherapy, CAR-T）及造血干细胞移植等治疗，仍有患儿最终因治疗失败而死亡，究其原因，是其发病机制尚未完全清楚，一些影响其预后的因素仍未被发现。Wnt信号通路与多种恶性肿瘤的发生发展和预后有密切关系，该通路中散乱蛋白（dishevelled, DVL）在结肠癌、乳腺癌及慢性粒细胞白血病等恶性疾病中已有研究，均提示DVL升高参与多种恶性肿瘤疾病的发生发展[3-5]，但在儿童ALL中尚未见报道。本研究通过检测儿童ALL骨髓血细胞DVL，探讨其在儿童ALL发病与预后中的作用及意义。
1 资料与方法 1.1 研究对象选取2016年10月至2018年10月于徐州医科大学附属医院就诊的新发ALL和免疫性血小板减少症（idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP）患儿为研究对象。ALL诊断、危险度分度和诱导治疗方案依据《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第四次修订）》[6]，ITP诊断符合《儿童原发性免疫性血小板减少症诊疗建议》[7]。ALL入组条件：新发患儿诱导治疗第33天达骨髓完全缓解者。符合入组条件的ALL患儿33例纳入病例组，男19例，女14例，年龄0.5~13岁，平均年龄4.5±3.1岁；ITP患儿29例纳入对照组，男18例，女11例，年龄0.6~12岁，平均年龄5.4±3.5岁；两组患儿年龄及性别构成比差异无统计学意义（P > 0.05）。ALL患儿化疗前为初发期，诱导化疗达完全缓解为缓解期。根据危险度将ALL患儿分为高危组（n=14），中危组（n=5）和低危组（n=14）。本研究获得医院医学伦理委员会批准，并经患儿监护人签署书面知情同意书。
1.2 主要试剂与仪器淋巴细胞分离液（MP Biomedicals公司，美国）、TRIzol（Invitrogen公司，美国）、cDNA第一链合成试剂盒（Thermo Fisher公司，美国）、Real time PCR Master Mix（TOYOBO公司，日本）、酶标仪（BioTek公司，美国）、荧光定量PCR循环仪（中山大学达安基因股份有限公司）、普通梯度PCR仪（ABI公司，美国）；引物由通用生物系统（安徽）有限公司设计合成。
1.3 标本制备采集患儿骨髓血2~3 mL，EDTA抗凝，密度梯度离心法分离单个核细胞，PBS液洗涤3次，置于EP管中，-80℃冰箱保存。
1.4 qRT-PCR相对定量法检测单个核细胞中DVL1、DVL2、DVL3 mRNA的表达参照TRIzol说明书提取总RNA，取已提取RNA样本至495 μL 1×TE Buffer中，测定260 nm和280 nm处吸光光密度（OD）值；OD260/280结果在1.8~2.1之间，抽提的RNA纯度符合实验要求。依据cDNA第一链合成试剂盒说明书进行反转录合成cDNA。DVL1上游引物：5' -GAGGGTGCTCACTCGGATG-3' ，下游引物：5' -GTGCCTGTCTCGTTGTCCA-3' ，片段长度158 bp；DVL2上游引物：5' -GAGGAAGAGACTCCCTACCTG-3' ，下游引物：5' -CGGGCGTTGTCATCTGAAAT-3' ，片段长度167 bp；DVL3上游引物：5' -GACGCCG-TACCTTGTGAAG-3' ，下游引物：5' -CGCTGCAAAA-CGCCCTTAAA-3' ，片段长度75 bp；GAPDH上游引物：5' -CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3' 、下游引物：5' -AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3' ，片段长度131 bp。PCR扩增反应体系：2×Real time PCR Master Mix 10 μL，模板（cDNA稀释10倍）1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，0.1% DEPC水7 μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸40 s，共40个循环；95℃变性15 s，骤冷至60℃，制作溶解曲线。DA 7600核酸扩增实时荧光检测系统软件分析Ct值，mRNA相对表达量采用2-△△Ct表示。
1.5 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件对数据进行统计学分析。符合正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，同组间多因子比较采用重复测量方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；初发组和缓解组比较采用配对t检验，初发组、缓解组分别与对照组比较采用两独立样本t检验；不符合正态分布计量资料采用中位数（四分位间距）[M（P25，P75）]表示，两组间及多组间比较采用非参数检验，组间两两比较采用Nemenyi法。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果病例组患儿初发期DVL1、DVL2、DVL3 mRNA水平均高于缓解期及对照组（P < 0.05）；与对照组比较，病例组缓解期DVL2 mRNA水平升高（P < 0.05），DVL1、DVL3 mRNA水平差异均无统计学意义（P > 0.05）。缓解期及初发期DVL2 mRNA水平均高于DVL1、DVL3 mRNA水平（P < 0.05），但两个时期DVL1与DVL3 mRNA水平比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；对照组DVL1、DVL2、DVL3 mRNA水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。
| 表 1 各组DVL1~3 mRNA相对表达量比较[x±s或M（P25，P75）] |
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高、中危组DVL1、DVL2 mRNA水平比较差异无统计学意义（P > 0.05），但均高于低危组（P < 0.05）；低、中、高危组DVL3 mRNA水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）。低、中、高危组DVL2 mRNA水平均高于DVL1、DVL3 mRNA水平（P < 0.05）；各组DVL1与DVL3 mRNA水平比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
| 表 2 不同病情严重程度初发患儿中DVL1~3 mRNA相对表达量比较[x±s或M（P25，P75）] |
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Wnt信号通路是一条复杂、高度保守的信号途径，分为经典途径即Wnt/β-catenin途径，和非经典途径，包括Wnt-平面细胞极性通路（Wnt-PCP pathway）和Wnt-钙离子通路（Wnt-Ca2+ pathway）等[8]。该信号通路在调节细胞分化周期、增殖和凋亡的平衡、细胞骨架重排、细胞间极性、细胞黏附和运动、细胞定向迁移、侵袭，以及维持细胞微环境的稳态中起重要作用[9-10]。Wnt信号通路中有多种作用因子及靶点，分为胞外、胞膜、胞内和核内四个作用场所。DVL是Wnt/β-catenin信号通路胞内关键因子之一，包括DVL1、DVL2、DVL3 [11]。当细胞跨膜受体（Frz）、LRP5/6与外界来源细胞分泌的Wnt蛋白结合，胞质内的转导通路信号被触发，Wnt通路开放，DVL被招募到细胞膜上，与Frz结合，导致GSK3β和CK1磷酸化[12]，无法形成降解β-catenin的复合物GSK3β-Axin-APC-CK1，使β-catenin在胞内积累并进入细胞核，与核内TCF/LEF-1结合，激活C-myc、CyclinD1、Survivin等靶基因[13]，导致肿瘤的发生；DVL亦可转移到细胞核中正向调控经典Wnt通路[14]。研究表明，DVL高表达参与了结直肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤等多种肿瘤的发生，并提示此类恶性疾病预后欠佳[3-4, 15]。
本课题组前期研究发现，在初发及高危儿童ALL中，β-catenin过表达，完全缓解后表达水平明显降低[16-17]，但机制并不清楚。本研究显示，DVL1、DVL2、DVL3在初发期ALL患儿中表达量明显高于缓解期及对照组，在初发期及缓解期患儿中DVL2的表达量明显高于DVL1和DVL3，而三者的表达在对照组中无差别。DVL高表达，GSK3β-Axin-APC-CK1复合物无法形成，β-catenin不能被降解，是β-catenin累积的原因之一，β-catenin过多累积，进入细胞核，最终激活C-myc、CyclinD1、Survivin等靶基因[18]，导致疾病发生，与本研究结果相符。因此本研究认为，DVL在儿童ALL的发病中起一定作用，尤其是DVL2。儿童ALL危险度受多种因素影响，除CCLG-ALL-2008诊疗建议已列出的因素外，目前仍有不少影响儿童ALL预后的独立因素陆续被发现，如IKZF1缺失，TCF3-HLF及MEF2D重排等[19-21]，将来肯定还会有更多的因素被发现。本研究结果显示，DVL1~2表达水平在高危组及中危组高于低危组，动态检测DVL的表达量，对判断儿童ALL的危险度及疗效有一定意义。但DVL，尤其DVL2为什么会增高，尚有待进一步研究。
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