2019, Vol. 21
白血病是小儿最常见的恶性肿瘤，目前仍采用以化疗为主的综合治疗。但反复化疗会导致机体重要脏器损伤和多药耐药的产生，限制了化疗在白血病治疗中的应用。自体造血干细胞移植（autologous hematopoietic stem cell transplantation, auto-HSCT）起初是作为治疗没有合适供者行异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT）的白血病患者的替代治疗方案，清髓性预处理后进行auto-HSCT，可以有比化疗更高的抗肿瘤效应，它不受供者的限制，不发生移植物抗宿主病，间质性肺炎等并发症也较轻，能减少移植相关死亡[1-3]。但由于微小残留病的存在及缺乏有效的移植物抗白血病效应，移植后复发率较allo-HSCT高。
紫外线照射已被证实可以诱导细胞的凋亡[4-5]。短期的中波紫外线（波长在280~320 nm）照射会引发细胞凋亡[6]，而长时间暴露会在体外诱导各种细胞系（包括HL-60细胞系）的坏死[7]。紫外线诱导细胞凋亡主要是由于DNA损伤、死亡受体激活和活性氧（ROS）的产生导致。本研究中紫外线照射采用紫外发光二极管，其在很多应用中已可以替代传统的紫外灯，例如灭菌、水净化和医疗[8-9]。
骨髓中存在着低氧的微环境，研究证明低氧可以诱导细胞凋亡，影响细胞存活和分化[10-11]。在体外研究中，通常通过降低大气氧浓度或通过利用模拟化学试剂如氯化钴（CoCl2）和去铁胺（DFO）诱导缺氧[12]。本研究中，旨在观察280 nm波长紫外发光二极管照射在低氧条件下对HL-60细胞增殖的影响，以期为自体移植的体外净化提供理论支持，通过体外给予低氧及紫外线照射减少自体移植物中微小残留，降低auto-HSCT的复发率。
1 材料与方法 1.1 材料IMDM培养基、胎牛血清（以色列BI公司），CCK-8（日本MEC公司），CoCl2（美国Sigma公司），RNAiso Plus试剂盒、Prime-ScriptTM RT reagent Kit逆转录试剂盒、SYBRPremix Ex TaqTM试剂盒（日本Takara公司），Annexin-FITC/PI双染流式试剂盒（美国BD公司）。
1.2 细胞培养与分组本研究采用急性早幼粒白血病细胞标准细胞株（HL-60细胞）为本研究所自己保存。实验分为正常对照组（对照组）、低氧处理组（低氧组）、紫外线照射组（紫外线组）、低氧+紫外线共同处理组（低氧+紫外线组）。将HL-60细胞按常规方法复苏、传代培养，待细胞进入对数生长期后用于实验。取生长状态好的细胞，对照组行常规培养，低氧组给予CoCl2（终浓度150 μmol/L）[13]处理，紫外线组用30 J/m2能量的280 nm波长紫外发光二极管照射131 s [14]，低氧+紫外线组在给予CoCl2处理基础上用30 J/m2能量的280 nm波长紫外发光二极管照射131 s。各组细胞均于37℃、5%CO2恒温培养箱培养，孵育48 h后收集细胞用于检测。倒置显微镜下观察各组细胞的形态并记录。
1.3 CCK-8法检测细胞增殖抑制率将各组待测细胞以4×104个细胞/孔的密度接种于无菌96孔培养板中，每孔加入10 μL CCK-8溶液，放入37℃、5%CO2恒温培养箱中孵育3 h，以加入无细胞的培养液为空白对照，在酶联免疫检测仪（美国Bio-Rad公司）上于450 nm波长处检测各孔吸光度值（OD），记录结果，实验独立重复3次。按照如下公式计算细胞增殖抑制率：
细胞增殖抑制率（%）=（对照组OD值-实验组OD值）/（对照组OD值-空白对照组OD值）×100%。
1.4 流式细胞术检测细胞凋亡将HL-60细胞以1×106个细胞/孔的密度接种在24孔板中，并按照分组分别进行相应处理。用PBS洗涤2次，以500 μL缓冲液悬浮细胞，分别加入AnnexinV-FITC 5 μL、PI 5 μL，避光孵育15 min，流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）检测细胞凋亡率，结果以早期凋亡和晚期凋亡细胞比例之和表示。实验独立重复3次。
1.5 实时荧光定量PCR法检测Bcl-2基因mRNA的表达将HL-60细胞以1×106个细胞/孔的密度接种在24孔板中，并按照分组分别进行相应处理。按照RNAiso Plus试剂盒提供的方法提取各组待测细胞的RNA。在冰浴上按PrimeScriptTM RT reagent Kit逆转录试剂盒说明书配制RT反应液，并逆转录合成cDNA。特异性扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成（表 1）。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）扩增反应体系（20 μL）：SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，dH2O 6.4 μL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环。根据测得的Ct值，计算Bcl-2 mRNA的相对表达量，结果以2-△△Ct表示，△△Ct=（实验组Bcl-2平均值-实验组GAPDH平均值）-（对照组Bcl-2平均值-对照组GAPDH平均值）。实验独立重复3次。
| 表 1 Bcl-2和GAPDH的引物序列表 |
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釆用SPSS 20.0统计软件对所有数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组细胞生长及形态改变倒置显微镜下观察可见，对照组细胞生长状况良好，随着培养时间的延长，细胞数量增多，细胞形态完整、圆形透亮、排列整齐；各实验组细胞皱缩、透亮度降低、排列紊乱，随着培养时间的延长，细胞数量减少，以低氧+紫外线组最为显著，可见死亡细胞及细胞分裂出的胞质小体。见图 1。
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图 1 不同处理条件下细胞形态变化（×100） 对照组细胞形态完整、排列整齐、数量增多；各实验组细胞皱缩、排列紊乱、数量减少，以低氧+紫外线组最为显著。 |
将对照组的增殖抑制率设为0。低氧组、紫外线组、低氧+紫外线组HL-60细胞增殖均产生明显抑制作用，抑制率分别为20.5%±1.0%、44.3%±2.1%、64.7%±3.3%，各组细胞增殖抑制率比较差异有统计学意义（F=267.326，P < 0.01）。紫外线组细胞增殖抑制率高于低氧组（P < 0.05），低氧+紫外线组细胞增殖抑制率明显高于紫外线组和低氧组（P < 0.05）。见图 2。
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图 2 各实验组HL-60细胞的增殖抑制率比较（n=3） 将对照组的增殖抑制率设为0。a示与低氧组比较，P < 0.05；b示与紫外线组比较，P < 0.05。 |
对照组、低氧组、紫外线组、低氧+紫外线组的细胞凋亡率分别为2.6%±1.2%、10.6%±0.7%、14.5%±1.5%、31.7%±1.3%，各组细胞凋亡率比较差异有统计学意义（F=319.507，P < 0.01）。低氧组、紫外线组和低氧+紫外线组细胞凋亡率均高于对照组（P < 0.05），紫外线组细胞凋亡率高于低氧组（P < 0.05），低氧+紫外线组细胞凋亡率明显高于低氧组和紫外线组（P < 0.05）。见图 3~4。
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图 3 流式细胞术检测各组HL-60细胞凋亡情况 AnnexinV(-)PI(-)为活细胞（Q4），AnnexinV(-)PI(+)为机械损伤细胞（Q1），AnnexinV(+)PI(-)为早期凋亡细胞（Q3），AnnexinV(+)PI(+)为晚期凋亡细胞（Q2），以早期凋亡和晚期凋亡细胞比例之和（Q2+Q3）计算细胞凋亡率 |
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图 4 各组HL-60细胞凋亡率比较（n=3） a示与对照组比较，P < 0.05；b示与低氧组比较，P < 0.05；c示与紫外线组比较，P < 0.05。 |
将对照组Bcl-2 mRNA相对表达量设为1，低氧组、紫外线组、低氧+紫外线组Bcl-2 mRNA的相对表达量分别为0.737±0.018、0.627±0.019、0.462±0.023，各组Bcl-2 mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义（F=612.602，P < 0.01）。低氧组、紫外线组和低氧+紫外线组细胞Bcl-2 mRNA表达量均低于对照组（P < 0.05），紫外线组Bcl-2 mRNA表达量低于低氧组（P < 0.05），低氧+紫外线组Bcl-2 mRNA表达量低于低氧组和紫外线组（P < 0.05）。见图 5。
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图 5 各组HL-60细胞Bcl-2 mRNA相对表达量比较（n=3） a示与对照组比较，P < 0.05；b示与低氧组比较，P < 0.05；c示与紫外线组比较，P < 0.05。 |
紫外线诱导细胞凋亡主要是由于DNA损伤、死亡受体激活和ROS的产生导致。紫外线照射诱导DNA损伤，产生2, 3-环丁烷嘧啶二聚体和嘧啶（6-4）嘧啶酮光产物，它可以有效地阻断复制和转录过程[15-16]。DNA损伤可导致p53激活，促进细胞周期阻滞蛋白p21WAF1/CIP1、DNA修复酶及抗凋亡基因的转录，为DNA修复提供时间，但当DNA损伤无法完全修复时，p53则触发细胞凋亡，防止受损DNA进入细胞导致肿瘤发生[17-18]。紫外线可以通过非配体依赖的方式诱导死亡受体肿瘤坏死因子（TNF）、Fas的聚集，作为凋亡的始动信号参与凋亡。已经证实紫外线照射诱导哺乳动物细胞的凋亡与Fas和TNF受体的活化相关[19]。紫外线还可以刺激ROS、活性氮和自由基的产生，造成生物大分子的损伤，诱导细胞凋亡[20-21]，紫外线诱导的ROS产生与线粒体电位下降有关[22]，ROS使得线粒体外膜发生脂质过氧化损伤，诱导线粒体膜电位下降，引起早期细胞色素C释放，从而促进细胞凋亡的诱导[23]。
低氧是肿瘤发展过程中所必须经历的环境条件之一，肿瘤细胞增殖迅速导致耗氧量增加，致使肿瘤微环境的一个显著特点就是局部低氧。在肿瘤细胞应对低氧的过程中，低氧诱导因子-1（HIF-1）介导的低氧信号转导通路的激活起着重要的作用。HIF-1是异二聚体转录因子，在常氧条件下通过蛋白酶体降解迅速被破坏，但在缺氧情况下，其降解缓慢，最终导致靶基因的表达增加[24]。HIF-1与线粒体通路中的某些蛋白存在着一定的关系[25]，如将促凋亡基因Bax等带到肿瘤低氧部位，诱导细胞的凋亡。低氧环境下，线粒体产生过量ROS，这可能导致大分子损伤，如脂质过氧化、蛋白质氧化、DNA氧化等，可能导致细胞损伤和死亡。除ROS外，线粒体还通过Ca2+螯合作用及存储和释放抗/促凋亡蛋白诱导细胞凋亡，如细胞色素C，凋亡诱导因子（AIF），Bcl-2基因等[26]。这与紫外线诱导细胞凋亡的途径类似。CoCl2可以阻断HIF-1降解来模拟缺氧情况[27]，在不同类型的细胞实验结果表明，CoCl2可以诱导细胞凋亡[28-30]。
本实验课题组已经证实280 nm波长紫外发光二极管照射可以抑制HL-60细胞的增殖并诱导细胞的凋亡及坏死[14]，且在低剂量30 J/m2的紫外发光二极管照射时诱导细胞凋亡最明显。但在骨髓造血微环境的低氧条件下，紫外线照射对HL-60细胞的影响仍有待阐明。在本研究中，发现280 nm波长紫外发光二极管照射在体外低氧条件下抑制HL-60细胞的增殖并诱导细胞凋亡，且在低氧条件下的紫外线照射诱导HL-60细胞凋亡能力比正常条件下照射诱导凋亡能力更强。
Bcl-2家族基因是线粒体介导的细胞凋亡的重要调节因子，可分为抗凋亡基因和促凋亡基因，Bcl-2可通过直接抗氧化、抑制Bax和Bak的活化、维持Ca2+稳态、抑制线粒体促凋亡蛋白质的释放等途径抑制凋亡[31-32]。在本研究中，低氧条件下30 J/m2的紫外线照射诱导细胞凋亡并抑制Bcl-2 mRNA表达，且诱导凋亡的能力比正常条件下更强，这表明低氧条件下280 nm波长紫外发光二极管照射对HL-60细胞的促凋亡作用与Bcl-2 mRNA表达的下调有关。
综上所述，280 nm波长紫外发光二极管照射可抑制HL-60细胞增殖并诱导细胞凋亡和坏死，且在低氧条件下抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡的能力更强。Bcl-2 mRNA表达的下调是导致细胞凋亡的部分原因，提示可能与线粒体介导的细胞凋亡有关，具体通路还需要进一步研究。
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