2019, Vol. 21
喘息是婴幼儿时期常见的临床病症，其发病率呈逐年上升趋势[1]，严重影响儿童健康和生活质量。40%~50%的婴幼儿发生过至少1次喘息，40%~50%的患儿喘息可持续超过6岁，部分可能发展为哮喘。呼吸道病毒感染和变态反应被认为是引起婴幼儿喘息发作甚至反复喘息的常见原因[2]。由于受到实验室条件和检测技术的限制，以往关于病毒检测分析的报道往往零碎而不全面，检测方法更多采用单份血清抗体测定和脱落上皮细胞中抗原检测，灵敏度和特异度偏低。本研究采用荧光探针PCR方法检测患儿鼻咽抽吸物中7种病毒，探讨不同病毒在婴幼儿喘息中的分布规律；并使用ImmunoCAP技术（国际公认的过敏性疾病体外检测的金标准）了解喘息患儿的过敏原分布，为喘息患儿的早期诊断与防治提供帮助。
1 资料与方法 1.1 一般资料选取2016年4月至2017年8月因喘息性支气管炎和喘息性支气管肺炎入住苏州大学附属儿童医院呼吸科的135例哮喘高危患儿为研究对象，其中男78例、女57例，男女比例为1.4 : 1；年龄范围7~21个月，中位年龄12个月。临床均表现咳嗽、气促、喘息，肺部听诊可闻及哮鸣音，诊断标准参照《诸福棠实用儿科学》[3]。入选标准：≤3岁，病程≤7 d，肺部听诊有哮鸣音，为第1次喘息或第2次喘息，且需具备以下任一条件：（1）有哮喘一级亲属家族史；（2）医师明确诊断的过敏性鼻炎、湿疹、食物过敏；（3）既往外周血嗜酸性粒细胞增多（> 4%）；（4）既往过敏原检测提示吸入性或食物性过敏原致敏Ⅱ级以上。排除标准：先天性呼吸道畸形、肺部发育不良等呼吸系统疾病，肺部影像学存在间质性肺疾病或重症肺炎，其他各种非呼吸道疾病引起的喘息，伴有心、肝、肾、血液等系统及代谢性疾病等。
本研究经苏州大学附属儿童医院伦理委员会审批批准（批准文号：2015LW006），征得患儿监护人同意并签署知情同意书。
1.2 痰液标本采集入院24 h内使用无菌负压吸痰法采集患儿鼻咽部分泌物。先清理鼻腔，后将吸痰软管经鼻腔插入7 cm左右达到咽部以下，吸取鼻咽部分泌物2 mL移入到加入无菌生理盐水的试管中，振荡混匀。合格标本的判断标准：白细胞 > 25个/低倍镜视野，鳞状上皮细胞 < 10个/低倍镜视野。
1.3 荧光定量PCR检测7种病毒（1）4倍体积的生理盐水加入至上述采集的鼻咽分泌物试管中，室温条件下1 800 r/min离心5 min，取上清；采用德国Qiagen公司的QIAamp MinElute Virus Spin Kit核酸提取试剂盒提取病毒核酸。（2）核酸扩增：采用广州中山大学达安基因股份有限公司的甲型流感病毒（Flu-A）、呼吸道合胞病毒（RSV）、腺病毒（ADV）、副流感病毒（PinF）、人鼻病毒（HRV）、人偏肺病毒（hMPV）、博卡病毒（HBoV）核酸检测基因盒，按照不同反应试剂及条件在荧光定量PCR仪上进行检测。仪器为美国BIO-RAD公司的Icycleriq荧光定量PCR仪。（3）结果判读：根据荧光曲线结果判定，结果以Ct值显示，通过2-△△Ct方法进行相对定量分析，电脑自动分析结果。
1.4 婴幼儿变应原过筛试验应用瑞典Pharmacia公司UniCAP250全自动荧光免疫分析系统，采用ImmunoCAP技术，进行酶联免疫吸附试验（ELISA），用吸附于测定帽中的各种抗原测定血清中的sIgE含量。具体方法如下：患儿入院后即采集静脉血4~5 mL，2 500 r/min离心10 min后留取血清进行过敏原检测。每项目检测需要40 μL血清，检测项目包括吸入性变应原户尘螨d1、粉尘螨d2、猫毛皮屑e1、狗毛皮屑e5、烟曲霉mx2、交链孢霉m6、春夏花粉tx4、夏秋花粉wx5、食物性变应原鸡蛋白f1、牛奶f2、总IgE（T-IgE）浓度，共计11项。将血清样本、参考血清分别加入已包被有吸入组混合变应原的反应杯中，经孵育、洗涤后加入酶标抗原抗体复合物，再加入荧光底物发色，测定荧光强度，UniCAP250仪器自动完成上述过程。结果判断：荧光强度 < 0.35 KU/L为0级（未检出特异性抗体），荧光强度≥0.35 KU/L为1级（极低抗体滴度，通常没有临床症状，但比较敏感），荧光强度≥0.70 KU/L为2级（低抗体滴度，如果在该类别上限，通常有症状），荧光强度≥3.5 KU/L为3级（特异性抗体滴度明显，通常出现临床症状），荧光强度≥17.5 KU/L为4级（高滴度的特异性抗体，总是出现临床症状），荧光强度≥50 KU/L为5级（特异性抗体滴度很高），荧光强度≥100 KU/L为6级（特异性抗体滴度很高）。
1.5 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计学分析。非正态分布计量资料以中位数（四分位间距）[M（P25，P75）]表示，两组间比较采用秩和检验。计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验、χ2校正检验或Fisher确切概率法。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 病毒病原检出情况及其分布135例患儿鼻咽部分泌物标本中，共有67例检出至少一种病毒，总病毒检出率为49.6%（67/135），各病毒检出阳性率由高到低依次为HRV 25.2%（34/135）、HBoV 9.6%（13/135）、RSV 8.1%（11/135）、PinF 5.9%（8/135）、Flu-A 3.7%（5/135）、ADV 1.5%（2/135）、hMPV 0.7%（1/135）。有7例为两种病毒混合感染，其中HRV混合感染占71%（5/7），HBoV混合感染占71%（5/7），PinF混合感染占29%（2/7）。
< 1岁患儿共62例，其中HRV检出率最高（16%，10/62），其次为RSV 10%（6/62）和PinF 10%（6/62）；1~3岁患儿共73例，也以HRV检出率最高（33%，24/73），其次为HBoV 11%（8/73）和RSV 7%（5/73）；HRV在1~3岁患儿中检出率高于 < 1岁患儿，差异有统计学意义（χ2=4.99，P < 0.05），其他病毒检出率在两年龄组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 1。
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图 1 各病毒感染例数在不同年龄组的分布 [RSV]呼吸道合胞病毒；[HRV]人鼻病毒；[HBoV]博卡病毒；[PinF]副流感病毒；[Flu-A]甲型流感病毒；[ADV]腺病毒；[hMPV]人偏肺病毒。a示与 < 1岁组比较，P < 0.05。 |
135例哮喘高危患儿中共80例经变应原筛查试验显示阳性，阳性率为59.3%（80/135），吸入性过敏原阳性率为44%（35/80），食物性过敏原阳性率为89%（71/80），两者均阳性占32%（26/80），食物性过敏原阳性率明显高于吸入性过敏原阳性率（χ2=36.23，P < 0.01）；吸入性过敏原中阳性率由高到低依次为尘螨77%（27/35）、霉菌37%（13/35）、花粉26%（9/35）、动物皮屑9%（3/35）；食物性过敏原中阳性率由高到低依次为鸡蛋白73%（52/71）、牛奶68%（48/71）。
< 1岁患儿吸入性过敏原阳性率高于1~3岁患儿（P < 0.05），食物性过敏原阳性率在两年龄组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）；1~3岁患儿T-IgE水平明显高于 < 1岁患儿（P < 0.05）（表 1）。两年龄组患儿尘螨、动物皮屑、霉菌、花粉阳性率比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
| 表 1 不同年龄患儿吸入性/食物性过敏原阳性率及T-IgE比较 |
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| 表 2 不同年龄不同种类吸入性过敏原阳性率比较 |
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在RSV、HRV、HBoV、PinF、Flu-A、ADV、hMPV感染患儿中，吸入性过敏原阳性率分别为73%（8/11）、24%（8/34）、31%（4/13）、38%（3/8）、60%（3/5）、50%（1/2）、100%（1/1），食物性过敏原阳性率分别为73%（8/11）、47%（16/34）、46%（6/13）、25%（2/8）、40%（2/5）、0、0。
病毒检出阳性患儿吸入性过敏原阳性率高于病毒未检出患儿（P < 0.05），食物性过敏原阳性率、T-IgE在两组患儿间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 3。
| 表 3 病毒检出与未检出患儿吸入性/食物性过敏原阳性率及T-IgE比较 |
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第1次喘息患儿RSV、HRV、HBoV、PinF、Flu-A、ADV、hMPV七种病毒检出率分别为8%（3/37）、19%（7/37）、11%（4/37）、0、5%（2/37）、0、3%（1/37），第2次喘息患儿分别为8%（8/98）、28%（27/98）、9%（9/98）、8%（8/98）、3%（3/98）、2%（2/98）、0；两组中均为HRV检出率最高，且两组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。
第2次喘息患儿吸入性过敏原阳性率、食物性过敏原阳性率及T-IgE高于第1次喘息患儿（P < 0.05）；T-IgE在两组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）；吸入性过敏原尘螨、霉菌在第2次喘息患儿中阳性率高于第1次喘息患儿（P < 0.05）。见表 4。
| 表 4 第1次喘息与第2次喘息患儿吸入性/食物性过敏原阳性率及T-IgE比较 |
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近年来年幼儿喘息性疾病和反复喘息越来越多，但由于导致年幼儿童喘息的原因较多，且适用于年长儿童或成人检测技术不适合年幼儿童，故年幼儿童哮喘的诊断一直是困扰医务人员的难点，也是当下研究的热点。一方面建立和评价一系列辅助检测技术及标准，如婴幼儿潮气呼吸肺功能、学龄前儿童脉冲震荡肺功能、潮气呼气一氧化氮、呼吸道分泌物嗜酸性粒细胞计数，是目前迫切需要解决的问题；另一方面研究年幼儿童喘息发作的临床特征、危险因素（包括过敏）、病原学特征，对年幼儿童哮喘早期预测与防治具有现实意义。
以往众多的临床观察发现，病毒性下呼吸道感染是婴幼儿期喘息的最常见原因[4]。由于受到实验室条件和检测技术的限制，以往关于病毒检测分析的方法更多采用单份血清抗体测定和脱落上皮细胞中抗原检测，灵敏度和特异度偏低，本研究采用荧光探针PCR方法检测哮喘高危患儿鼻咽部抽吸物病毒核酸，总病毒检出率为49.6%，与国内文献报道的38.04%~73.70%[5-6]相符。其中以HRV检出率最高，被认为是最主要的呼吸道疾病病因[7-9]，有报道称，HRV常与其他类型病毒混合存在（RSV最常见）[10]，与本研究结果一致。澳大利亚的一项高危出生队列研究[11]发现，第一年婴幼儿HRV感染引起喘息与其5岁时支气管哮喘的发生风险呈正相关，同时Kotaniemi-Syrjanen等[12]报道也指出2岁内因喘息住院的婴幼儿，与其他病毒感染相比，HRV感染居多，今后发生哮喘的风险高出4倍，且特应性体质患儿更易感染HRV，可能由于特应性体质患者出现Th1/Th2失衡，Th1参与了限制病毒复制相关细胞因子的表达，如IL-12、IFN-α和IFN-γ，在过敏性哮喘患者中，这些因子表达减少，向Th2免疫偏离，利于HRV的复制，此外由T辅助细胞（Th）参与HRV免疫反应中细胞因子的合成和释放，如IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IL-13，其能增加HRV受体—细胞间黏附分子（ICAM-1）在支气管上皮细胞（BEC）表面上的表达，这可能使该细胞更容易受到感染，增加了HRV感染的严重程度，故早期HRV感染是哮喘发生的高危因素[13]。刘金辉等[14]研究显示病毒混合感染是引起婴幼儿喘息发作的一个危险因素，但有关病毒混合感染对疾病的影响还有待于进一步研究。
婴幼儿病毒感染与喘息关系十分密切，但不同的病毒引起喘息的机制和作用不尽相同[15]。Rossi等[16]研究认为，生命早期的RSV感染是以后反复喘息甚至哮喘的危险因素，是启动因子；而HRV则是哮喘发作的触发因素，是引起儿童喘息的常见病毒病原[17]。Malmström等[18]在反复发生喘息的婴儿支气管上皮内检测到HRV，并且它的存在与呼吸道阻力增加有关。但是本研究结果中HRV在第1次喘息与第2次喘息患儿间检出率并无明显差异，可能系本研究样本量较少所致。
特应性体质是发展为持续性哮喘的独立危险因素[19]。体外吸入性变应原过筛试验（Phadiatop）是一种筛查吸入性过敏原的重要检测方法[20]。Fx5是一种筛查食物性过敏原的重要检测方法。Phadiatop+Fx5联合检测可有效帮助鉴别婴幼儿和儿童IgE介导的相关性疾病，是体外变应原筛查的理想方法。135例患儿中Phadiatop+Fx5试验阳性率59.3%，提示喘息患儿呈现较高比例的特应性体质。本研究发现第2次喘息患儿吸入性过敏原阳性率及食物性过敏原阳性率均明显高于第1次喘息患儿，提示反复喘息与机体过敏状态有关。
本研究中食物性过敏原阳性率明显高于吸入性过敏原阳性率，可能是由于婴幼儿期消化道屏障功能差，食物致敏成分易通过疏松连接的上皮细胞间隙进入血液循环，从而引起皮肤、胃肠道和呼吸道过敏症状。多项研究指出支气管哮喘儿童最常见的吸入性变应原是尘螨和真菌，本研究中吸入性过敏原阳性率由高到低依次为尘螨77%、霉菌37%、花粉26%、动物皮屑9%，且吸入性过敏原尘螨、霉菌在第2次喘息患儿中阳性率高于第1次喘息患儿。本研究中 < 1岁年龄组吸入性过敏原阳性率高于1~3岁年龄组，与一些调查结果不一致，可能是本研究入选对象为哮喘高危儿。有研究表明，早期出现对吸入性过敏原过敏，并且反复喘息的儿童，进展成持续哮喘或发生其他特应性疾病危险性增高[21-22]，这也正是哮喘预测指数中的主要危险因素，而食物过敏被列入次要危险因素。另外，年幼儿童由于免疫系统发育的不成熟，及对环境中变应原接触的负荷强度不同所得结果可能有一定差异，必要时可以在3~6个月重新检测。1~3岁年龄组T-IgE高于 < 1岁年龄组，考虑系随着年龄增长，免疫系统及功能发育越来越完善，变应原接触增多，刺激机体产生较多IgE。本研究中病毒检出组吸入性过敏原阳性率大于病毒未检出组，病毒感染与吸入性过敏原阳性之间的关系值得重视，其机制有待进一步探讨。
综上所述，早期HRV感染和吸入性过敏原阳性与喘息发生密切相关，特应性体质和呼吸道病毒感染之间关系密切，在其双重作用下，喘息的发病率会明显提高。故了解婴幼儿喘息的相关因素（包括病原学特征及特应性体质），对哮喘高危儿的早期识别并进行干预治疗具有现实意义。
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