2019, Vol. 21
2. 浙江省绍兴市人民医院儿科, 浙江 绍兴 312000
分节丝状菌（segmented filamentous bacterium, SFB）是一种革兰阳性、产芽孢厌氧菌，广泛存在于多种脊椎动物及无脊椎动物肠道内的一类形态结构特异的“原籍”细菌[1]。既往相关研究多为动物实验研究，结果表明SFB与宿主的免疫成熟密切相关，它能促进宿主sIgA的分泌、调控T细胞的分化和平衡、诱导Th17细胞的分化、抵抗外来致病菌的感染[2-3]。这类细菌常出现在宿主动物免疫系统成熟前后（幼年时期），一旦宿主动物进入成年期，这类细菌大多消失。通过对小鼠、大鼠和鸡的研究，发现SFB在动物中定植存在年龄依赖关系，随着年龄的增长，SFB的定植逐渐减少[4-5]。SFB在人类肠道是否存在一直有争议。Yin等[6]通过PCR技术发现人SFB肠道定植且存在年龄依赖关系，在7~12个月龄时SFB阳性率最高（78.6%），到3岁后阳性率降低。Caselli等[7]在溃疡性结肠炎患者回盲瓣部位发现类似SFB细菌，这是形态学的定植依据。SFB在人类肠道定植特点及年龄分布特征需要更多的依据来明确，其与肠道黏膜免疫的关系尚不清楚。本研究旨在通过RT-PCR技术了解不同年龄儿童粪便SFB检出率，并通过测定肠液中的sIgA浓度、回肠末端IL-17A细胞数量、上皮内淋巴细胞数量，及Th17细胞、Th1细胞、Treg细胞等细胞分化相关转录因子表达，初步探讨儿童SFB肠道定植年龄分布特征及其与肠黏膜免疫的关系。
1 资料与方法 1.1 研究对象收集在浙江大学医学院附属儿童医院住院的0~15岁非胃肠道疾病、非感染性疾病患儿的新鲜粪便，排除抗生素应用及益生菌应用史，共有177例（男100例，女77例）患儿纳入本研究。
另选择因腹痛或便血在浙江大学医学院附属儿童医院行肠镜检查未发现大肠明显异常的患儿，收集其回盲部肠液，共有47例获得肠液，年龄8个月至9岁1个月。另外，肠镜检查到达回肠末端者取回肠黏膜，纳入回肠黏膜病理未见明显异常者24例，年龄1岁3月至12岁1个月。
1.2 标本采集（1）粪便标本：收集符合纳入标准的患儿粪便标本，用无菌的竹签将新鲜粪便装入收集管中，然后放到装有冰块的保温罐中，1 h内送到实验室，分装到1.5 mL灭菌离心管中，放置在-80℃冰箱保存备用。
（2）肠液标本：采集电子结肠镜检查时回盲部肠液至无菌吸引瓶中，再用无菌吸引管吸取20 mL左右至试管，然后放置在-80℃冰箱保存备用。
（3）回肠末端黏膜标本：电子结肠镜进镜至回肠末端时，活检回肠末端黏膜，迅速放入收集管中，用10%福尔马林溶液固定。
1.3 SFB标准质粒鉴定和16S rRNA目的基因PCR扩增（1）SFB引物设计和合成：从GenBank中获取SFB的序列，根据细菌的16S rRNA特异性基因序列，设计其特异性引物，并在BLAST基因库（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）中进行比对，验证其特异性。SFB引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，上游引物5' -TGTGGGTTGTGAATAACAAT-3' ，下游引物5' -GCGGGCTTCCCTCATTACAAGG-3' ，目的片段长度229 bp。SFB标准质粒由浙江省农科院植微所免疫微生态实验室提供。
（2）SFB标准质粒常规PCR扩增的反应体系和条件：标准质粒倍比稀释，10×缓冲液5 μL, 上游引物（10 μM）1 μL，下游引物（10 μM）1 μL，模板DNA 5 μL, dNTP Mixture 4 μL，TaKaRa LA Taq酶0.5 μL，ddH2O 33.5 μL，总反应体积50 μL。所用PCR仪为Biometra Tpersonal PCR仪。PCR条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃5 min。取10 μL PCR扩增产物与1 μL 10×loading Buffer混合后，在含有约0.5 mg/L溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳（50 mA），约20 min后于凝胶成像仪中观察，确认电泳条带，以验证引物的特异性[8]。
1.4 粪便及肠液SFB的定性测定（1）粪便、肠液菌群DNA的提取及浓度测定：所用试剂为QIAgen DNA Stool Mini Kit试剂盒，按说明书进行操作，用微量紫外分光光度计（NanoDrop®ND-1000）测定粪便及肠液菌群DNA浓度。已纯化洗脱的DNA置于-20℃冰箱中保存。
（2）实时荧光定量PCR反应体系及条件：所用试剂盒为SYBR Premix Ex Taq，所用仪器为ABI7500型实时荧光定量PCR扩增仪。具体方法为：取SFB标准质粒、空白对照（ddH2O）及样本为模板，进行实时PCR反应，每个样本均做2个复孔。反应体系：SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，模板DNA X μL，ddH2O Y μL（X为50 μg÷模板DNA浓度，Y=11.5-X），总反应体积25 μL。反应条件：95℃ 2 min，1个循环；95℃ 45 s，60℃45 s，40个循环；95℃ 15 s，60℃1 min，95℃15 s，1个循环。得到SFB标准质粒及样本的扩增曲线、熔解曲线，实时PCR产物再经2%琼脂糖凝胶电泳，确认SFB条带[9]。
1.5 ELISA法测定肠液sIgA浓度冰冻保存的肠液于4℃放置2 h后，取5 mL，予1 000 r/min离心20 min，取上清液1.5 mL入微量离心管。提前配置好所有试剂，如洗涤液、标准品及稀释液、生物素化抗体工作液、酶结合物工作液，各试剂均应平衡至室温，并制作标准曲线，按说明书进行操作。如样品浓度过高时，按样品稀释液进行稀释。用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度（OD值），根据标准曲线计算出样品sIgA浓度，再乘以稀释倍数，即为样品sIgA的实际浓度。
1.6 免疫组化法测定回肠黏膜免疫相关细胞数量及Th细胞分化相关转录因子表达（1）免疫组化法：石蜡切片经连续切片成厚3~4 μm，捞在防脱的载玻片上，60~62℃烘箱（DHG-9140A型电热恒温箱）烤片2 h。二甲苯脱蜡10 min×2次、无水乙醇3 min×2次、95%乙醇2 min×2次、80%乙醇2 min、70%乙醇2 min，至水化，蒸馏水洗涤。高温高压抗原修复后，3% H2O2水溶液阻断内源性过氧化物酶，滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育60 min（用PBS代替一抗为实验的空白对照）。滴加山羊抗兔或小鼠IgG抗体-HRP多聚体的二抗，37℃孵育40 min。DAB显色液显色1 min，自来水冲洗终止反应。Harris苏木素液复染细胞核1 min，95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。免疫组织化学染色黄色或黄棕色为阳性，细胞核衬染呈蓝色。
（2）免疫组化阳性结果的判断和分析：CD45阳性主要表达在所有淋巴细胞的胞膜上，每个标本观察6~10个绒毛，计数每个绒毛上皮层内每100个柱状上皮细胞间淋巴细胞数，再换算成百分比（%）。
IL-17A、FOXP3和ROR-γt表达在肠道黏膜上皮细胞和固有层内的淋巴细胞等胞浆内，其具体的表达程度采用半定量计分的方法，即染色阳性强度计分和阳性细胞百分比计分的乘积。（1）染色强度计分，即0分：无色；1分：淡黄色；2分：棕黄色；3分：棕褐色。（2）阳性细胞所占的百分比计分，即0分：阴性；1分：阳性细胞≤10%；2分：11%~50%；3分：51%~75%；4分：> 75%。
T-bet阳性细胞数采用百分数（%）表示，即每张切片在200倍视野下计数200个以上细胞中T-bet染色阳性的细胞数，换算成阳性指数（%），即视野内的阳性细胞数/视野内总的细胞数×100%。
1.7 统计学分析应用SPSS 17.0统计软件分析实验数据。计量资料用均数±标准差（x±s）或中位数（四分位数间距）[P50（P25，P75）]表示。两组之间差异比较用独立样本t检验或非参数秩和检验，趋势分析采用Cochran-Armitage检验。P < 0.05示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 一般临床资料（1）采集粪便标本的患儿年龄分组：0岁~组20例，1岁~组19例，2岁~组19例，3岁~组20例，4岁~组17例，5岁~组15例，6岁~组13例，7~15岁组54例。
（2）采集了肠液标本的患儿分组：根据肠液SFB测定结果分为SFB阳性组（n=24，女8例，男16例）和SFB阴性组（n=23，女6例，男17例）。
（3）采集了回肠黏膜标本的患儿分组：根据肠液SFB测定结果，将采集了回肠黏膜的患儿分为SFB阳性组（n=12，女1例，男11例）和SFB阴性组（n=11，女2例，男9例）。
2.2 SFB标准质粒经PCR扩增产物的鉴定（1）SFB标准质粒的鉴定：图 1所示，SFB标准质粒倍比稀释后经PCR扩增产物的电泳条带，位于1、2、3、4道，与目标基因229 bp大小相符。
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图 1 SFB标准质粒经PCR扩增产物琼脂糖电泳 1~4泳道为SFB标准质粒，浓度分别为10-3、10-2、10-1、1；5泳道为ddH2O。 |
（2）样本DNA经过实时PCR扩增产物的鉴定：如图 2所示，除了样本2、5、7泳道及ddH2O阴性对照泳道外，各个电泳条带与目标基因229 bp大小相符。条带的亮度不同，代表样本中SFB DNA的浓度不等。
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图 2 SFB标准质粒和样本DNA经实时PCR扩增产物的验证 1~7泳道为样本DNA；8泳道为ddH2O；9泳道为SFB标准质粒。 |
在收集的177例粪便样本中，34例（19.2%）SFB阳性，其在各个年龄段的分布呈现年龄依赖关系，其中0岁~组SFB阳性率是40%，1岁~组最高，达47%，而7岁后阳性率明显下降，仅4%。Cochran-Armitage趋势检验显示，肠道SFB定植阳性率随着年龄的增加呈降低趋势（χ2=4.778，P < 0.001），可以看出SFB在3岁以内婴幼儿定植率较高（表 1、图 3）。
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图 3 肠道SFB在各个年龄段阳性率趋势图 |
| 表 1 肠道SFB在各年龄段的分布 |
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SFB阳性组肠液sIgA浓度较SFB阴性组明显升高，分别为111±31、72±23 μg/mL，其差异有统计学意义（t=4.835，P < 0.01）。
2.5 SFB定植对回肠末端黏膜上皮内淋巴细胞和IL-17A细胞数量的影响SFB定植与未定植者回肠末端黏膜上皮内淋巴细胞数量的差异无统计学意义（P > 0.05）；而IL-17A细胞在SFB阳性组较SFB阴性组明显减少，其差异有统计学意义（P < 0.05），如表 2、图 4所示。
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图 4 回肠末端黏膜IL-17A细胞数量比较 （免疫组化染色，×100）SFB阳性组（图B）IL-17A细胞数量少于SFB阴性组（图A）。黄色或褐色细胞为阳性细胞。 |
| 表 2 回肠末端黏膜免疫相关细胞数量 |
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SFB定植后回肠黏膜转录因子FOXP3及ROR-γt较未定植组有所增高，但差异无统计学意义（P > 0.05）；而转录因子T-bet较未定植组有所减少，差异也无统计学意义（P > 0.05）。见表 3。
| 表 3 回肠末端黏膜免疫相关转录因子的表达 |
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SFB的定植与年龄密切相关，这主要归因于宿主随着年龄增加而日趋成熟的免疫系统[4-6]。如在小鸡中，SFB并不是在小鸡孵化出壳后马上就定植到肠道中，而是在小鸡生长到1周左右（第6天）才出现的，之后SFB的数量逐渐增高，第2、3周内数量稳定在一定的高度，之后又开始降低，下降期与回肠内sIgA的增加相一致[4]。在小鼠中，回肠中SFB在断奶后到自身产生的IgA前这段期间内迅速增加，而后又逐渐下降[5]。SFB选择性地定植在回肠，是因为SFB高度依靠其他生物提供营养，回肠细菌的密度非常高，可能为SFB的定植提供了必需的物质[10]。SFB在宿主体内的定植，不仅受自身产生的sIgA或外来的sIgA（如母乳）的影响，而且还受到其他因素的影响，如饮食、生活环境等[11]。而饮食在肠道菌群的变化中是个重要因素，如用高动物脂肪、少蔬菜和膳食纤维的食物喂养的老鼠，肠道中厚壁菌多于拟杆菌[12]，所以饮食是可以通过肠道菌群的改变而改变SFB的定植。Jin等[13]证实小剂量青霉素可引起肠道菌群的改变，关键是SFB的清除，并进一步抑制IL-17的表达和回肠IL-17细胞的分化，而青霉素的这种抑制作用是SFB依赖的。
虽然关于SFB在动物的定植、分布及宿主关系的研究较多，但在人类中的研究非常少，需要进一步的验证。对于人肠道SFB的分布调查，多根据小鼠SFB的全基因序列来检测是否存在SFB。Prakash等[14]及Sczesnak等[15]在263例人肠道宏基因中未能确定SFB的序列，提出人粪便中不存在SFB的观点。但Caselli等[7]在溃疡性结肠炎患者回盲瓣部位发现类似SFB细菌，并通过PCR技术证实溃疡性结肠炎患儿回肠黏膜存在SFB，且与炎症的活动度有关[9]。Yin等[6]通过PCR技术发现SFB在人类中定植并存在年龄依赖关系，在7~12个月龄时阳性率最高（78.6%），到3岁后阳性检测率显著降低。并发现儿童24个月以前肠道sIgA水平相当低且稳定，而SFB的定植在24个月后逐渐下降，推测肠道内sIgA影响了SFB的定植。本研究通过PCR技术，检测各年龄段儿童粪便中SFB阳性率的差异，结果表明SFB在3岁以内阳性率较高，3岁以后则明显下降，与既往报道[6]基本一致。
在动物模型中，SFB肠道定植与sIgA的产生相互影响，一方面，SFB的定植受到肠内sIgA浓度的影响，但另一方面，SFB的定植可以影响肠内sIgA的浓度[16-18]。Klaasen等[19]研究发现，相比无菌小鼠，单一定植SFB小鼠的回肠和盲肠黏膜sIgA细胞数量明显上升，而血清IgA和肠道sIgA的滴度也随之增加。Ohashi等[5]发现，小鼠粪便IgA量和粪便SFB的数量呈正相关。Talham等[20]发现，无菌小鼠肠腔中IgA接近于0，但单一SFB定植后，其浓度达到普通小鼠肠腔IgA浓度的2/3。本研究通过测定SFB阳性及阴性儿童肠液中sIgA的浓度，发现SFB定植在人体内后，能显著促进肠道sIgA的分泌。这一现象符合单一定植SFB的动物模型实验，证明SFB能促进sIgA的分泌。而sIgA是局部肠道黏膜免疫屏障重要功能分子，sIgA抑制肠道内的细菌黏附肠道黏膜表面的作用是通过黏膜内蠕动和绒毛清除来阻止黏膜与病原体的接触[21]。SFB通过肠道定植和粘附于肠上皮细胞，尤其是潘氏小结，诱导和增强肠道IgA的分泌[16]。而一旦IgA产生，即具有控制SFB生长的能力，但如肠道IgA缺乏，可促使SFB生长[16, 18]。所以SFB的定植，可通过调控肠道sIgA的分泌从而促进肠道黏膜免疫功能的成熟和功能的发挥。
哺乳动物在刚刚出生或无菌状态下，免疫系统主要依靠Th2细胞来应答, 但暴露于肠道细菌后，可导致其他T淋巴细胞亚群的分化如Th1、Treg细胞和Th17细胞[3, 22-23]。例如脆弱拟杆菌定植后不仅可优化系统Th1/Th2的平衡，还可以诱导肠道Treg细胞分化[24]。与其他共生菌区别的是：SFB粘附在无菌小鼠回肠末端肠上皮细胞后，可特异性地诱导Th17细胞生成，但不影响Th1或Treg细胞比例，且不侵犯上皮细胞，不穿透上皮细胞屏障，不引起肠道炎症[22-23]。本研究通过免疫组化方法，测定SFB阳性及阴性儿童回肠末端黏膜IL-17A细胞、上皮内淋巴细胞数量，以及与Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞等细胞分化相关的转录因子表达，发现SFB定植对回肠黏膜表面肠道上皮内淋巴细胞数量，以及与Th17细胞、Treg细胞、Th1细胞分化相关的转录因子的表达影响均不大。肠道上皮内淋巴细胞、Th1细胞及Th17细胞在肠道抗感染、抗肿瘤反应中发挥重要作用，特别是Th17细胞具有强大的致炎症潜能，是自身免疫性疾病的重要介导细胞[25]。Treg细胞是一种具有免疫抑制作用和抗炎作用的细胞，可以减轻组织损伤T细胞对宿主的损伤，减轻过度的炎症反应。本研究发现，SFB阳性者并没有明显促进肠道上皮T细胞的分化，这与动物模型中的实验结果是有区别的[22]。考虑SFB在动物中定植与在人类中定植对宿主的免疫功能影响可能是不同的，SFB在人类中定植对宿主T细胞的影响需要进一步研究。
本研究还发现，SFB阳性者回肠末端黏膜Th17细胞的分化相关的转录因子表达与阴性者无明显差异，但SFB定植组IL-17A细胞数量较未定植组IL-17A细胞数量明显减少，这与其他文献报道不同[22, 26]。我们推测Th17细胞是一群重要的介导炎症反应的细胞，分泌的细胞因子除了IL-17A外，还包括IL-17F，以及IL-21、IL-22、IL-6、TNF-α等细胞因子，人与动物的Th17细胞产生的相关因子可能是不一样的，人类肠道SFB定植后，Th17细胞分泌的细胞因子类型的变化需要进一步研究。
综上所述，本研究结果表明，儿童SFB肠道定植与年龄相关，随年龄增加呈降低趋势，其中3岁以内婴幼儿定植率较高；SFB阳性者肠道sIgA分泌增加，回肠末端IL-17A细胞数量减少；SFB肠道定植对儿童免疫功能的影响尚需进一步研究。
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