中国当代儿科杂志  2019, Vol. 21 Issue (7): 670-675  DOI: 10.7499/j.issn.1008-8830.2019.07.010

引用本文  

徐佳露, 章毅, 赵聪颖, 等. 13例早发型腓骨肌萎缩症的基因分型研究[J]. 中国当代儿科杂志, 2019, 21(7): 670-675.
XU Jia-Lu, ZHANG Yi, ZHAO Cong-Ying, et al. A genotyping study of 13 cases of early-onset Charcot-Marie-Tooth disease[J]. Chinese Journal of Contemporary Pediatrics, 2019, 21(7): 670-675.

基金项目

国家青年科学基金(81501084)

作者简介

徐佳露, 女, 博士, 主治医师

通信作者

高峰, 男, 主任医师。Email:epilepsy@zju.edu.cn

文章历史

收稿日期:2019-01-09
接受日期:2019-04-30
13例早发型腓骨肌萎缩症的基因分型研究
徐佳露 , 章毅 , 赵聪颖 , 江佩芳 , 袁哲锋 , 余永林 , 夏哲智 , 高峰     
浙江大学医学院附属儿童医院神经内科, 浙江 杭州 310052
摘要目的 探讨早发型腓骨肌萎缩症(CMT)的临床特征及遗传变异分析。方法 以临床诊断为早发型CMT的患儿为研究对象,收集相关临床资料,进行肌电图及CMT相关基因检测并分析。结果 早发型CMT病例共13例,男9例(69%),女4例(31%),平均就诊年龄4.0±2.1岁,其中12例(92%)患儿起病年龄 < 2岁。9例(69%)诊断为CMT1型(其中Dejerine-Sottas综合征6人),1例(8%)为中间型,3例(23%)为CMT2型。13例患儿的基因检测结果显示6例(46%)患儿存在外周髓鞘蛋白22(PMP22)基因重复突变、3例(23%)髓鞘蛋白零(MPZ)基因插入突变及点突变、3例(23%)线粒体融合蛋白2(MFN2)基因点突变、1例(8%)人轻肽神经丝蛋白(NEFL)基因点突变,其中11例(85%)为已知致病突变,2例(15%)为新变异。MPZ基因新变异c.394C > G(p.P132A)评级为"可能致病的"及MFN2基因新变异c.326A > G(p.K109R)评级为"致病的"。结论 早发型CMT以PMP22基因重复突变及MPZ基因突变为主,临床分型以CMT1型为主,其中Dejerine-Sottas综合征占有相当比例。
关键词腓骨肌萎缩症    外周髓鞘蛋白22基因    髓鞘蛋白零基因    线粒体融合蛋白2基因    人轻肽神经丝蛋白基因    高通量测序    儿童    
A genotyping study of 13 cases of early-onset Charcot-Marie-Tooth disease
XU Jia-Lu , ZHANG Yi , ZHAO Cong-Ying , JIANG Pei-Fang , YUAN Zhe-Feng , YU Yong-Lin , XIA Zhe-Zhi , GAO Feng     
Department of Neurology, Children's Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310052, China
Abstract: Objective To study the clinical characteristics and genetic variation of early-onset Charcot-Marie-Tooth disease (CMT).Methods Children with a clinical diagnosis of early-onset CMT were selected for the study. Relevant clinical data were collected, and electromyogram and CMT-related gene detection were performed and analyzed.Results A total of 13 cases of early-onset CMT were enrolled, including 9 males (69%) and 4 females (31%). The mean age at consultation was 4.0±2.1 years. Among them, 12 children (92%) had an age of onset less than 2 years, 9 children (69%) were diagnosed with CMT type 1 (including 6 cases of Dejerine-Sottas syndrome), 1 child (8%) with intermediate form of CMT, and 3 children (23%) with CMT type 2. The genetic test results of these 13 children showed 6 cases (46%) of PMP22 duplication mutation, 3 cases (23%) of MPZ gene insertion mutation and point mutation, 3 cases (23%) of MFN2 gene point mutation, and 1 case (8%) of NEFL gene point mutation. Eleven cases (85%) carried known pathogenic mutations and 2 cases (15%) had novel mutations. The new variant c.394C > G (p.P132A) of the MPZ gene was rated as "possibly pathogenic" and the new variant c.326A > G (p.K109R) of the MFN2 gene was rated as "pathogenic".Conclusions Early-onset CMT is mainly caused by PMP22 gene duplication mutation and MPZ gene mutations. The clinical phenotype is mainly CMT type 1, among which Dejerine-Sottas syndrome accounts for a considerable proportion.
Key words: Charcot-Marie-Tooth disease    PMP22 gene    MPZ gene    MFN2 gene    NEFL gene    High-throughput sequencing    Child    

腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT),又称遗传性运动感觉神经病(hereditary motor and sensory neuropathy, HMSN),是一组具有高度临床和遗传异质性的周围神经单基因遗传病,发病率约为1/2 500[1]。CMT的遗传模式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传及X-连锁遗传。目前发现80余个基因的1 000余个突变均可导致CMT的发生[2-3],其中外周髓鞘蛋白22(peripheral myelin protein 22, PMP22)、间隙连接蛋白β1(gap junction protein beta 1, GJB1)、髓鞘蛋白零(myelin protein zero, MPZ)、线粒体融合蛋白2(mitofusin 2, MFN2)四个基因的突变占总突变的近95%[4]。随着多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)及二代基因测序技术,如基因panel、全外显子组测序技术等的发展及应用,对于CMT的认识不再局限于传统的临床分型。如何确定突变基因,特别是新变异的致病性,确定基因分型,成为了当今分子诊断的难点所在。而美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)于2015年重新修订的序列变异解读标准和指南[5],基于人群数据、计算数据、功能数据、共分离数据等,对基因的变异进行分级,为解读工作提供了指向。本文通过对13例早发型CMT患儿的临床特征、家族史及基因检测结果进行分析,最终确定患儿的基因分型。

1 资料与方法 1.1 研究对象

以2014年4月至2018年3月在浙江大学医学院附属儿童医院临床诊断为早发型CMT的13例患儿为研究对象,其中男9例(69%),女4例(31%),其中12例(92%)患儿起病年龄 < 2岁,平均就诊年龄4.0±2.1岁。

对于早发型CMT采用诊断标准[6-7]:(1)发病年龄 < 10岁;(2)慢性起病,缓慢进展的肢体远端尤其是双下肢远端的肌无力和肌萎缩,典型者成鹤腿畸形;(3)肌电图显示周围神经性受损;(4)神经活检证实周围神经损害;(5)家族史阳性;(6)弓形足或脊柱侧凸;(7)排除以下疾病:慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、糖尿病性周围神经病、酒精中毒性周围神经病、周围神经淀粉样变性、进行性脊髓性肌萎缩症、脊髓亚急性联合变性等。

患儿须具备上述第(1)、(2)、(3)、(7)四条及第(4)、(5)、(6)中任何一条。若家族中已有确诊者,再具备第(1)、(2)条即可诊断。

1.2 CMT临床分型

基于神经电生理和病理特点,CMT的临床分型可初步分为(1)脱髓鞘型(CMT1型):正中神经运动传导速度(motor nerve conduction velocity, MNCV) < 38 m/s,神经活检示显著的节段性脱髓鞘,施万细胞增生,呈“洋葱头”样改变;其中正中神经MNCV < 12 m/s者亦称Dejerine-Sottas综合征(Dejerine-Sottas syndrome, DSS);(2)轴索型(CMT2型):正中神经MNCV > 38 m/s,神经活检示慢性轴索变性和再生,有髓纤维减少,神经再生簇形成;(3)中间型:正中神经MNCV介于25~45 m/s,神经病理兼具脱髓鞘和轴索变性特点。

1.3 资料采集

收集患儿相关临床资料:性别、就诊年龄、起病年龄、起病症状、家族史及神经系统体征。

1.4 周围神经病相关基因高通量测序

抽取患儿外周静脉血3 mL,放置EDTA抗凝管中,送至北京金准基因科技有限责任公司,采用周围神经病相关106个基因panel检测。发现基因点突变时,根据选取位点的位置用Primer 5设计、合成引物,进行PCR扩增,对高通量测序结果中的变异位点进行Sanger测序验证;发现基因重复突变时,对捕获区域进行覆盖度计算及均一化处理,检测出可能发生拷贝数变异的区域,经MLPA检测基因(主要针对PMP22基因),确认重复范围;对亲属进行Sanger测序突变位点验证,根据家系共分离结果进一步判断其致病性。

应用人类基因突变数据库(HGMD, http://www.hgmd.cf.ac.uk)确认已报道的致病基因位点。对于新变异位点,应用ESP数据库(http://evs.gs.washington.edu/EVS)、千人数据库(http://browser.1000genomes.org)、ExAC数据库(http://exac.broadinstitute.org)进行正常对照人群变异比对,应用ACMG指南标准对新变异进行评级。

2 结果 2.1 临床表现

5例(38%)患儿存在运动发育落后,独走年龄 > 18月,伴行走不稳、平衡能力差、易摔倒、步态异常。13例(100%)患儿均存在远端肢体无力,4例(31%)伴远端肢体萎缩,6例(46%)伴上肢受累,1例(8%)伴脊柱侧凸。见表 1

表 1 13例早发型CMT患儿基本信息及临床表现
2.2 肌电图结果

肌电图显示正中神经MNCV < 25 m/s者9人,介于25~45 m/s者1人,> 45 m/s者3人,可分为CMT1型9人(69%),中间型1人(8%),CMT2型3人(23%)。9例CMT1型患儿中,有6例正中神经MNCV < 12 m/s,即DSS;有5例(病例1、2、4、8、13)正中神经复合肌肉动作电位(compound muscle action potential, cMAP)均降低,提示合并轴索损害;且正中神经感觉神经传导速度(sensory nerve conduction velocity, SNCV)及感觉神经动作电位(sensory nerve action potential, SNAP)均未能引出。见表 2

表 2 13例早发型CMT患儿的肌电图结果
2.3 基因诊断

13例患儿的基因检测结果显示11例(85%)为已知致病突变,2例(15%)为新变异,其中5例(38%)存在家族史。突变基因包含PMP22重复突变(6例,46%)、MPZ基因插入突变及点突变(3例,23%)、MFN2基因点突变(3例,23%)及人轻肽神经丝蛋白(NEFL)基因点突变(1例,8%)。2例新变异分别为MPZ基因c.394C > G(p.P132A)及MFN2基因c.326A > G(p.K109R)。见表 3

表 3 13例早发型CMT患儿突变基因、核苷酸及氨基酸改变信息
2.4 新变异分析

病例1携带MPZ基因c.394C > G(p.P132A)杂合变异,病例5携带MFN2基因c.326A > G(p.K109R)杂合变异。Sanger测序验证两位患儿的父母均未携带相应变异,该患儿为新发(de novo)变异。两个基因变异位点在哺乳动物中高度保守。见图 1~2


图 1 病例1家系图、Sanger测序图及保守序列分析 图A示病例1家系图,■为先证者,○为健康女性,□为健康男性;图B示MPZ蛋白第132号氨基酸位点在哺乳动物中高度保守;图C示患儿存在MPZ基因c.394C > G(p.P132A)杂合突变,父母在该位点均未携带突变(箭头所示)。


图 2 病例5家系图、Sanger测序图及保守序列分析 图A示病例5家系图,■为先证者,○为健康女性,□为健康男性;图B示MFN2蛋白第109号氨基酸位点在哺乳动物中高度保守;图C示患儿存在MFN2基因c.326A > G(p.K109R)杂合突变,父母在该位点均未携带突变(箭头所示)。

应用ACMG序列变异解读标准对2个新变异进行评级。MPZ基因c.394C > G(p.P132A)杂合变异,为新发变异,无家族史,符合PS2;该变异为ESP数据库、千人数据库、ExAC数据库正常对照人群中未发现的变异,符合PM2;SIFT、PolyPhen-2、PROVEAN软件的生物信息数据分析预测提示“有害的”,MutationAssessor预测提示“致病性中等”;因此该变异被判定为“可能致病的”。MFN2基因c.326A > G(p.K109R)杂合变异,也为新发变异,无家族史,符合PS2;MFN2蛋白第107~111号氨基酸为核苷酸结合域,影响GTP的结合[8-9],符合PS3;该变异为ESP数据库、千人数据库、ExAC数据库正常对照人群中未发现的变异,符合PM2;经SIFT、PolyPhen-2、PROVEAN、MutationAssessor软件的生物信息数据分析预测,均提示为“有害的”,符合PP3;因此该突变被判定为“致病的”。见表 4

表 4 新变异的ACMG致病性分级
3 讨论

CMT是一组具有高度临床和遗传异质性的周围神经系统遗传病,诊断需结合临床分型及基因分型。二代测序技术的发展正改变着CMT基因诊断的方式。包含所有已知CMT相关基因的基因panel检测是如今最经济、最高效、最直接的基因检测方式,这能让临床医生在第一时间对所有CMT基因的突变情况有一个整体的了解。它能很好的体现基因型-表型的对应关系,为临床的治疗、随访提供可靠保障。但新变异的临床意义解读是临床工作的一个难点所在。2015年,ACMG提出了适用于所有孟德尔基因变异,包括单基因、多基因包、外显子组和基因组测序发现的遗传变异的解读标准与指南[5]

本研究共确诊13例早发型CMT患儿,6例(46%)PMP22基因重复突变,3例(23%)MPZ基因点突变,3例(23%)MFN2基因点突变及1例(8%)NEFL基因点突变,这与之前Cornett等[10]报道的CMT患儿前三位的突变基因一致。而对于占总体CMT人群突变第二位的GJB1基因,却并非CMT患儿的主要突变基因。这是由于在脱髓鞘型中,PMP22基因重复突变、MPZ、NEFL基因突变的患者多表现为早发型;而在轴索型中,几乎所有的MFN2基因突变的患者表现为早发型,而GJB1基因突变患者无论表现为脱髓鞘型或轴索型,起病年龄均相对较晚[11]

本研究中6例患儿起病年龄早,且正中神经MNCV < 12 m/s,符合DSS的诊断标准。突变基因包括3例MPZ基因突变和3例PMP22基因重复突变,与之前文献报道的DSS多数为MPZ及PMP22(包括整体重复及点突变)相一致[12]。近年来,DSS更被看做是一个临床综合征,尽管DSS患儿起病年龄早,且MNCV显著降低,提示着严重的脱髓鞘或者无髓鞘形成,但Gabreëls-Festen等[12]对25例DSS患者进行随访发现,仍有1/3的患者在平均年龄39.9岁时尚可独立行走1 km以上。DSS的出现并非预示着成人期的严重残疾及轮椅依赖的可能。

近年来,多项研究均提示MNCV虽能作为临床分型的主要指标,但却与疾病的进展不相平行。而cMAP尽管与起病年龄不相关,却关乎病程长短及疾病的严重程度,特别是在PMP22基因重复突变及MPZ基因突变的患者中,cMAP与远端肌力密切相关[13-14]。文中CMT1型患儿中有5人cMAP低于同龄儿,表明该型患儿除脱髓鞘病变外尚还存在轴索病变,且也预示着患儿相对预后不良。

综上,本研究依据患儿的临床表现、神经肌肉电生理特征、遗传模式、二代测序结果,结合临床分型及基因分型,采用ACMG标准对新变异致病性进行分析,共确诊早发型CMT 13例,为临床CMT的诊断确定基础。

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