2019, Vol. 21
早产儿过早脱离母体，脑发育易受各种不良宫外因素及并发症影响，导致神经及认知发育异常。文献报道[1]，极早早产儿认知功能障碍发生率达40%。认知障碍等脑功能问题很大程度影响早产儿生长发育，并对今后学校教育甚至成年产生负面影响[2]。研究发现，肠道菌群紊乱可影响认知功能，生后早期小鼠肠道益生菌群丰度和菌群多样性下降引起成年小鼠焦虑与认知行为改变[3]。肠道菌群与大脑之间的关系可追溯到脑发育。胎儿出生后，环境中的微生物在婴儿肠道内定植并且在大脑发育过程中起着非常重要的作用[4]。Diaz Heijtz等[5]研究结果显示，与无特定病原体小鼠相比，无菌小鼠大脑前额皮质多个亚区域中突触可塑性相关基因mRNA表达明显降低，下丘脑、杏仁核等区域中的突触素表达明显降低，提示肠道菌群定植在一定程度上影响了大脑发育。抑郁症及孤独症等存在认知障碍的精神神经变性疾病均存在肠道菌群异常改变[6-7]。应用益生菌可有效改善宿主焦虑、抑郁、认知功能、自闭及应激反应等一系列神经系统功能失调[8]，提示肠道菌群在大脑发育及认知功能形成过程中起重要作用。目前有关早产认知障碍与肠道菌群关系的研究较少。本研究通过建立早产认知障碍大鼠模型，比较早产认知障碍组与正常对照组大鼠肠道菌群结构、多样性及丰度差异，从微生态角度探讨早产认知障碍与肠道菌群的关系，为早产认知障碍微生态治疗干预提供新靶点。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器脂多糖（LPS，美国Sigma公司），QIAamp® DNA Stool Mini Kit试剂盒（德国QIAGEN公司），带有Barcode的16S V4通用引物（515F-806R）（美国Life公司），GoTaq® Hot Start Colorless Master Mix高效高保真酶（美国Promega公司）。
Morris水迷宫实验和跟踪系统由江苏大学医学院实验室提供，-80℃冰箱（德国西门子），MD荧光定量检测仪（美国Molecular Device公司），Illumina MiSeq测序仪（美国Illumina公司），Onedrop仪器（南京五义科技有限公司）。
1.2 早产认知障碍大鼠模型建立SPF级孕16~17 d健康Sprague-Dawley（SD）孕鼠，由江苏大学动物房提供，体重370~450 g，实验动物质量合格证号：201819539，动物实验许可证号：SYXK（苏）2013-0036。参照文献建立认知障碍大鼠模型[9]，给孕16~17 d SD大鼠连续2 d腹腔内注射LPS，每次330 μg/kg；以腹腔内注射PBS为对照。孕21 d行剖宫产术，将早产大鼠随机分给健康代母鼠喂养；获得30只模型组早产大鼠和15只对照组早产大鼠，并进行编号。每只代母鼠喂养5只早产大鼠，室温25.0±0.5℃，12 h昼/夜周期，普通大鼠饲料喂养，自由取食和饮水，喂养30 d。SD大鼠1月龄时约等同于人类2~5岁，即幼儿期，此时认知功能发育正常与否基本能够充分展示[10]，故选择生后30 d大鼠进行认知功能研究。Morris水迷宫实验是公认的评估啮齿类动物认知障碍的金标准[11]，本研究利用Morris水迷宫中的定位航行实验对大鼠进行认知功能评估，即找到平台时间越长得分越低，认知功能越低[12]。两组大鼠在生后30 d进行Morris水迷宫定位航行实验，从30只模型组大鼠中选择定位航行得分最低的21只大鼠作为早产认知障碍组，从15只对照组大鼠中选择定位航行得分最高的10只大鼠作为正常对照组。重新编号后进行肠道菌群检测。
1.3 大鼠粪便样本采集和贮存两组大鼠生后30 d收集大便标本：一手戴无菌手套，一手抓大鼠尾部，用75%乙醇棉球消毒大鼠肛门部位，轻柔按摩大鼠腹部刺激排便，用无菌小镊子取大鼠新排在无菌滤纸上的大便2~3粒，放入5 mL灭菌离心管中。收集标本封口后立即放入-80℃冰箱保存。
1.4 海马组织标本采集与处理Morris水迷宫实验后处死两组大鼠，采用4%多聚甲醛固定，取全脑，常规脱水，石蜡包埋，切片，行苏木精-伊红（HE）染色，观察海马细胞形态学变化。
1.5 大便16S rRNA测序流程选用QIAamp® DNA Stool Mini Kit试剂盒对样本基因组DNA进行提取，采用Onedrop仪器和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。取2.5 ng稀释后的基因组DNA作为模板，使用带有Barcode的16S V4通用引物（515F-806R）、GoTaq® Hot Start Colorless Master Mix高效高保真酶进行PCR。PCR产物使用MD荧光定量检测DNA浓度；根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用QIAquick® PCR Purification Kit试剂盒纯化回收产物。回收产物后进行第二轮扩增，引入Illumina桥式PCR兼容引物，扩增产物使用Pico Green荧光定量及Agilent 2200 TapeStation电泳工作平台检测，合格后使用MiSeq进行上机测序。采用Illumina MiSeq测序平台得到下机数据，对高通量测序的原始数据首先根据Barcode信息，将单个样品数据拆分出来，取出引物序列，进行测序序列质量控制；通过质量检查序列，应用Ribosomal Database Project（RDP）Classifier 2.3，使用Silva数据库进行序列比对，确定每条序列的分类等级（界、门、纲、目、科、属、种）；应用Mothur进行分类操作单元（operational taxonomic units, OTUs）划分，以序列相似性97%为标准，将这些序列划分为OTUs，并按照序列数量生成OTU丰度谱。菌群丰富度及多样性是指一个特定区域或者生态系统内菌群的丰富度及多样性，常用的度量标准有Chao1指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数。Chao1指数及Ace指数主要用于计算物种的丰富度，Chao1指数和Ace指数越大，代表样本中菌群越丰富；Shannon指数及Simpson指数主要用于计算物种多样性，Shannon指数越大，Simpson指数越小，代表样本中菌群多样性程度越高。
1.6 统计学分析应用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析，符合正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组样本间比较采用两样本t检验。不符合正态分布计量资料以中位数（四分位间距）[M（P25，P75）]表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。两组间肠道菌群主成分分析（principal component analysis, PCA）应用方差分解，对多维数据进行降维后提取出数据中最主要的元素和结构。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 Morris水迷宫定位航行实验在定位航行实验前，早产认知障碍组大鼠平均体重为109±8 g，正常对照组大鼠平均体重为106±7 g，两组大鼠平均体重比较差异无统计学意义（t=1.08，P > 0.05）。在定位航行实验第5天，早产认知障碍大鼠找到平台的平均时间为40±5 s，明显长于正常对照组（18±4 s），差异有统计学意义（t=13.29，P < 0.05）。
2.2 两组大鼠海马神经元病理变化正常对照组大鼠海马神经元结构清晰，大小正常，细胞核呈淡蓝染色，呈圆形、椭圆形排列。早产认知障碍组大鼠海马神经元数目明显减少，细胞排列不整齐，可见大量神经元变性坏死。见图 1。
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图 1 两组大鼠海马神经元病理变化（苏木精-伊红染色） 正常对照组大鼠海马神经元结构清晰，大小正常，细胞核呈淡蓝染色；早产认知障碍组大鼠海马神经元数目明显减少，细胞排列不整齐，可见大量神经元变性坏死。 |
与正常对照组相比，菌群丰富度指标Chao1指数及Ace指数在早产认知障碍组显著降低（P < 0.05）；而代表菌群多样性的Shannon指数在早产认知障碍组也显著低于正常对照组（P < 0.05），Simpson指数在两组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。
| 表 1 两组大鼠肠道菌群丰富度及多样性指标比较 |
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所有样本菌群主要由拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、螺旋菌门（Spirochaetae）构成，这4个菌门包含了所有样本丰度98.4%的肠道细菌。其中，拟杆菌门和厚壁菌门为大鼠肠道菌群的优势菌群。早产认知障碍组拟杆菌门、厚壁菌门及螺旋菌门丰度与正常对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05），变形菌门丰度较正常对照组显著增加（P < 0.05）。见图 2，表 2。
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图 2 两组大鼠肠道菌群门水平分布 横坐标表示所有样本，纵坐标表示每个菌门的相对丰度。早产认知障碍组：LS1~LS21；正常对照组：LT01~LT10。 |
| 表 2 两组大鼠肠道菌群门水平优势菌群比较 |
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目、科、属水平上能检测到的菌种有97种，取含量前30种进行绘图比较。与正常对照组比较，早产认知障碍组大鼠肠道中条件致病菌寡养杆菌属、嗜冷杆菌属、葡萄球菌科、肠球菌属相对丰度显著增高（P < 0.05）；而普氏菌属、乳杆菌属、拟杆菌目、普雷沃氏菌属、副杆菌属、梭菌目、另枝菌属相对丰度显著降低（P < 0.05）。见表 3，图 3。
| 表 3 两组大鼠肠道菌群目、科、属水平优势菌群比较 |
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图 3 两组大鼠肠道菌群目、科、属水平分布 横坐标表示所有样本，纵坐标表示每个菌群的相对丰度。早产认知障碍组：LS1~LS21；正常对照组：LT01~LT10。 |
PCA分析显示，正常对照组大鼠各样本点间距离较小，提示正常对照组大鼠肠道菌群较为相似，但早产认知障碍组大鼠各样本点间距较大，表明小鼠肠道菌群在实验条件下产生了较大的差异；且两组样本点之间距离也较大，提示两组大鼠在肠道菌群构成上差异明显。见图 4。
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图 4 主成分分析 第一主成分（PC1）=28.87%表示PC1对样品差异的贡献值；第二主成分（PC2）=19.17%表示PC2对样品差异的贡献值。 |
Morris水迷宫实验能有效筛选出认知障碍大鼠。本研究结果发现，与正常对照组大鼠相比，在定位航行实验中，早产认知障碍大鼠找到平台的平均时间明显延长，提示存在认知障碍。海马是脑边缘系统的重要组成部分，是负责情感和认知功能的关键脑区[13]。海马神经损伤会显著影响大鼠学习记忆能力及认知功能。本研究中大鼠海马组织HE染色结果发现，早产认知障碍大鼠海马组织神经元数目明显减少，细胞排列不整齐，可见大量神经元变性坏死，进一步说明认知障碍与海马组织损伤有关。
肠道微生物被称为机体第二基因组，是人体不可分割的基因组成部分[14]。Mayer [15]通过MRI扫描大脑结构并比较肠道内细菌类型发现，大脑区域间连接不同，其肠道菌群也不同，推测肠道细菌在脑发育过程中可能帮助塑造大脑结构。Sudo等[16]研究发现，无菌小鼠大脑皮层和海马组织中脑源性生长因子（BDNF）的表达量明显降低，并可能影响情绪、行为及感觉，提示肠道微生物作为重要的环境因素可影响大脑发育和功能。肠道微生物多样性的平衡对于维持宿主的健康状况至关重要[17]，普遍认为，肠道菌群多样性越高，越有利于健康。在描述疾病相关微生物群的文献中，肠道菌群多样性减低是许多疾病的共同特征，如克罗恩病、肠易激惹综合征、糖尿病、哮喘、孤独症等肠道菌群多样性均有下降，移植正常肠道菌群对这些疾病有治疗作用[18]。Desbonnet等[3]研究发现，小鼠口服抗生素降低肠道菌群多样性及丰富度的模型中，小鼠出现认知障碍，同时小鼠海马组织表达BDNF及5-羟色胺（5-HT）水平下降，BDNF在脑中有神经保护作用，海马组织中BDNF表达下降会降低学习和记忆功能，5-HT水平下降会导致焦虑行为，考虑肠道菌群多样性及丰富度下降可致小鼠BDNF及5-HT表达量下降是导致认知障碍的一个重要原因。本研究中对两组大鼠肠道菌群多样性分析发现，正常对照组肠道菌群种类组成的丰富度及多样性高于早产认知障碍组，这和既往在啮齿类动物中的研究结论相一致，小鼠肠道微生物群的菌群缺失可导致小鼠过度应激及焦虑行为[3, 19]，推测在发育阶段，某些肠道菌群种类的缺失可能会影响宿主认知功能形成。
早产儿由于胃肠功能不成熟、出生体重低、抗生素使用等原因导致肠道菌群定植延迟，多样性丰度显著减少，达优势化时间延迟。本研究两组大鼠肠道菌群门水平差异性分析发现，早产认知障碍大鼠肠道菌群变形菌门丰度较正常对照组明显增高。研究发现[20]，变形菌门丰度越高，肠道菌群紊乱越明显，变形菌门增多已成为肠道菌群紊乱的标志物，变形菌门增多可引发肠道炎症及慢性炎症免疫应激。Yang等[21]发现，慢性应激显著影响前额叶皮层神经元形态和功能，暴露于慢性应激状态下的小鼠前额叶皮层细胞萎缩和髓鞘形成障碍，进一步影响认知功能。所以我们推测，变形菌门丰度增高导致肠道菌群紊乱，引起肠道炎症，导致慢性炎症应激反应，是早产认知障碍的一个重要病因。
在目、科、属水平上，Berrington等[22]研究发现，早产儿专性厌氧菌水平降低，肠杆菌科和肠球菌科等兼性厌氧菌水平增加。Scheperjans等[23]发现，患有神经系统疾病患者普雷沃氏菌、乳杆菌等菌属的丰度较正常人明显降低。存在认知障碍的孤独症患儿普氏菌属和拟杆菌属较正常儿童丰度明显减低[24]。本研究显示，两组肠道菌群在科、目、属水平上有着明显差异，主成分分析结果显示，认知障碍大鼠与正常对照组大鼠肠道菌群构成上有明显差异，早产认知障碍大鼠中普氏菌属、乳杆菌属、拟杆菌目、普雷沃氏菌属、副杆菌属、梭菌目、另枝菌属较正常对照组相对丰度减低；而寡养杆菌属、嗜冷杆菌属、葡萄球菌科、肠球菌属相对丰度较正常对照组增高。普氏菌属、乳杆菌属、拟杆菌目、普雷沃氏菌属、另枝菌属可以产生短链脂肪酸（SCFAs）。SCFAs是结肠细菌发酵的主要产物，可调节肠道菌群、维持体液和电解质的平衡，以及为宿主提供能量[25]。同时，SCFAs可调节血脑屏障通透性，维持中枢神经系统内环境稳定，如果SCFAs降低则认知障碍发生的风险增高，进而影响大脑发育及行为[26]。研究发现，乳杆菌属能够产生γ-氨基丁酸（GABA）[27]，GABA是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质，具有保护认知功能的作用。而肠道寡养杆菌属、嗜冷杆菌属、葡萄球菌科、肠球菌属丰度增加往往会导致炎症因子长期过量释放，对大脑发育产生不利影响。
早产认知障碍大鼠肠道菌群结构发生明显变化，其丰富度及多样性降低，肠道菌群紊乱，普氏菌属、乳杆菌属、拟杆菌目、普雷沃氏菌属、另枝菌属等益生菌群丰度减低，寡养杆菌属、嗜冷杆菌属、葡萄球菌科、肠球菌属等有害菌群丰度增加，这些肠道菌群的变化可能是早产认知障碍发生的可能原因。这些发现可为早产认知障碍微生态治疗干预提供新靶点，目前肠道菌群改变如何影响早产认知障碍仍有待进一步研究。
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