2019, Vol. 21
2. 黄河三门峡医院儿科, 河南 三门峡 472000
社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia, CAP）作为儿童下呼吸道感染的常见病之一，具有发展快、预后不一的特点，严重时可累及循环、消化、神经等系统，甚至危及患儿生命[1]。及早诊断并明确CAP的病情严重程度、识别高危患儿对于改善CAP的预后具有重要意义[2]。近来研究发现，中性粒细胞胞外网状陷阱（neutrophil extracellular traps, NETs）作为中性粒细胞杀菌的第二种机制，在多种感染性疾病以及自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮）中发挥重要作用[3-5]。抗菌肽-37（antibacterial peptide-37, LL-37）和胞外游离DNA（circulating cell-free DNA, cfDNA）是反映NETs水平的两个间接血清标志物，能够间接反映体内NETs的形成情况[6-7]。DNA酶Ⅰ（deoxyribonuclease I, DNaseⅠ）作为降解胞外形成的NETs的重要酶，能够直观反映NETs在体内的降解情况[8]。目前有国外学者提出NETs与感染性疾病有关，外周血中NETs水平与CAP患者病情严重程度有关[9]。然而，目前国内尚未见关于NETs与儿童呼吸道及肺部感染等相关疾病关系的研究报道。因此，本研究拟通过对CAP患儿血浆中NETs进行检测，探讨NETs及相关标志物与儿童CAP病情严重程度的关系，以期为疾病的临床监测提供一定参考依据。
1 资料与方法 1.1 一般资料选择2016年2月至2018年2月于郑州大学附属儿童医院就诊的160例CAP患儿为研究对象，其中男87例，女73例，发病年龄3.7±1.2岁。纳入标准：（1）符合2013年儿童社区获得性肺炎管理指南[10]的诊断标准；（2）存在肺炎症状及体征（发热和呼吸系统症状）；（3）入院时患儿年龄大于28 d，小于5岁；（4）父母或监护人知情同意。排除标准：（1）入院前抗菌药物治疗 > 48 h；（2）伴潜在慢性呼吸系统疾病；（3）哮喘、反复呼吸道感染病史；（4）贫血、佝偻病、免疫功能低下者；（5）有遗传代谢性疾病者。参照2013年儿童社区获得性肺炎管理指南[10]中重症肺炎的诊断标准[存在以下任意一项：拒食或脱水征；意识障碍；婴儿呼吸频率（RR） > 70次/min、年长儿RR > 50次/min；紫绀；呼吸困难；多肺叶或≥2/3的肺受累；脉搏血氧饱和度≤92%；肺外并发症等]，将CAP组分为轻度CAP亚组137例，重度CAP亚组23例。根据病原体不同分为3个亚组：细菌性肺炎亚组78例，支原体肺炎亚组35例和病毒性肺炎亚组47例。
另选择同期于本院体检的健康儿童50例作为对照组，其中男26例，女24例，年龄4.0±0.9岁。
1.2 研究方法采集所有研究对象的一般资料及实验室检查，包括入院时体重、心率、RR，入院时血常规、C-反应蛋白（C-reactive protein, CRP）、降钙素原（procalcitonin, PCT）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）及病原学等。
1.3 血浆NETs及相关标志物水平测定EDTA抗凝管抽取所有研究对象入院时空腹静脉全血10 mL。根据参考文献[11]，采用免疫荧光法定量检测外周血NETs水平。利用中性粒细胞分离液（AXIS-SHIELD）分离中性粒细胞，重悬于含5%胎牛血清的1640培养液中，并在预包了多聚赖氨酸的载玻片上培养2 h。经磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline, PBS）洗涤后固定于4%多聚甲醛溶液20 min。PBS洗涤后，加入1% Triton X-100冰浴1 min。PBS洗涤后，加入血清封闭液孵育20 min，之后加入髓过氧化物酶（MPO）特异性抗体孵育2 h，再加入FITC标记的山羊抗兔IgG孵育1 h。滴加含有4' , 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）荧光淬灭封片液，盖上盖玻片，封片。于荧光酶标仪读取荧光值（激发波长485 nm，发射波长525 nm），以相对荧光强度表示NETs的形成量。采用PicoGreen试剂盒（Thermo Fisher, P7589）测定血浆cfDNA含量。采用LL-37 ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，CSB-E14948h）测定血浆中LL-37的浓度；采用辐射状酶扩散法测定血浆DNaseⅠ活性。
1.4 统计学分析采用SPSS 17.0进行数据处理。呈正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验。计数资料以例和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法。采用Pearson法分析变量间的相关性。采用受试者工作特征曲线（ROC）分析NETs及相关标志物对CAP诊断及病情严重程度的预测价值。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 一般资料CAP组和对照组年龄与性别差异无统计学意义（P > 0.05），但CAP组WBC、中性粒细胞百分比（N%）、RBC、CRP、PCT、TNF-α水平均高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。轻度CAP亚组和重度CAP亚组间年龄、性别、RBC、PCT、TNF-α差异无统计学意义（P > 0.05），但重度CAP亚组WBC、N%、CRP水平均高于轻度CAP亚组，差异有统计学意义（P < 0.05）。细菌性肺炎亚组、支原体肺炎亚组和病毒性肺炎亚组间年龄、性别、WBC、N%、RBC、CRP、PCT、TNF-α差异无统计学意义（P < 0.05）。见表 1~3。
| 表 1 CAP组和对照组一般资料及实验室指标比较 |
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| 表 2 轻度CAP亚组与重度CAP亚组一般资料和实验室指标比较 |
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| 表 3 细菌性肺炎亚组、支原体肺炎亚组和病毒性肺炎亚组的一般资料和实验室指标比较 |
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与对照组相比，CAP组NETs、LL-37、cfDNA水平显著增加，DNaseⅠ活性显著降低（P < 0.05）；重度CAP亚组NETs、LL-37、cfDNA水平显著高于轻度CAP亚组，DNaseⅠ活性显著低于轻度CAP亚组（P < 0.05）。见表 4~5，图 1。
| 表 4 对照组与CAP组NETs及相关标志物水平比较 |
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| 表 5 轻度CAP亚组与重度CAP亚组NETs及相关标志物水平比较 （x±s） |
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图 1 免疫荧光法定量检测外周血中NETs水平（200×） 使用4', 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）进行DNA染色，以髓过氧化物酶（MPO，绿色）进行NETs染色。DAPI和MPO共染后，通过免疫荧光显微镜评估NETs的相对荧光强度。 |
细菌性肺炎亚组、支原体肺炎亚组、病毒性肺炎亚组间NETs、LL-37、cfDNA水平及DNaseⅠ活性的差异无统计学意义（P > 0.05），见表 6。
| 表 6 不同病原体亚组NETs及相关标志物水平比较 |
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NETs与LL-37、cfDNA呈正相关（分别r=0.502、0.497，P < 0.05），而与DNaseⅠ活性呈负相关（r=-0.458，P < 0.05），见图 2~4。
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图 2 CAP组外周血NETs与LL-37水平相关分析图 |
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图 3 CAP组外周血NETs与cfDNA水平相关分析图 |
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图 4 CAP组外周血NETs与DNaseⅠ活性相关分析图 |
CAP组NETs与WBC、N%、CRP、PCT、TNF-α呈正相关（P < 0.05）；LL-37、cfDNA与WBC、CRP呈正相关（P < 0.05）；DNaseⅠ活性与CRP呈负相关（P < 0.05）。见表 7。
| 表 7 NETs及相关标志物与CAP组临床指标相关性分析 |
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NETs、LL-37、cfDNA、DNaseⅠ诊断CAP的曲线下面积（AUC）分别为0.844、0.648、0.727、0.913（图 5、表 8）；最佳截断值分别为182.89、46.26 ng/mL、233.13 ng/mL、0.39 U/mL；灵敏度分别为88.12%、35.63%、54.37%、91.25%；特异度分别为74.00%、92.00%、86.00%、76.00%。鉴别重度CAP的AUC分别为0.873、0.924、0.820、0.778（图 6、表 8）；最佳截断值分别为257.7、49.11 ng/mL、252.54 ng/mL、0.29 U/mL；灵敏度分别为83.21%、86.96%、78.26%、95.65%；特异度分别为78.26%、83.94%、76.64%、56.93%。
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图 5 NETs及相关标志物对CAP诊断价值的ROC分析图 [NETs]中性粒细胞胞外网状陷阱；[LL-37]抗菌肽-37；[cfDNA]胞外游离DNA；[DNaseⅠ] DNA酶Ⅰ |
| 表 8 NETs、LL-37、cfDNA及DNaseⅠ对CAP诊断及病情严重程度的预测价值 |
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图 6 NETs及相关标志物对CAP严重程度预测价值的ROC分析图 [NETs]中性粒细胞胞外网状陷阱；[LL-37]抗菌肽-37；[cfDNA]胞外游离DNA；[DNaseⅠ] DNA酶Ⅰ。 |
CAP是儿科最常见的疾病之一，流行病学调查结果显示，CAP已成为发展中国家儿童死亡的第二大原因，死亡人数占儿童总死亡人数的1/5 [12]。目前临床上对儿童CAP的早期明确诊断存在一定难度，探索与CAP相关的新血清学标志物，对于儿童CAP发病及病情严重程度的及早诊断与治疗具有重要临床意义。
中性粒细胞作为固有免疫系统中重要的效应细胞，能够在炎症发生时抵御外来微生物对人体的入侵，在连接先天性免疫与获得性免疫中发挥关键作用。经典的中性粒细胞杀伤机制主要通过释放氧自由基和各种蛋白酶，研究表明，中性粒细胞能够在胞外形成由核酸物质和颗粒蛋白组成的网状结构，即NETs，捕杀病原体，发挥抗细胞免疫效应，是中性粒细胞杀菌并阻止病原微生物在机体内扩散的新方式[13]。中性粒细胞作为气道中重要的细胞类型，其经典杀伤功能在呼吸道感染的发生发展中起重要作用，但NETs在其中的具体作用机制目前尚未明确。近来研究发现，NETs与多种自身免疫性疾病和炎症性肺疾病有关[14]。中性粒细胞被病原微生物激活后，通过释放由双链DNA、组蛋白、蛋白酶类和抗菌肽形成的NETs来识别、捕获并捕杀金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌等多种革兰阳性菌、革兰阴性菌以及病毒等[15-16]。但由于组成NETs的组蛋白、弹力蛋白酶、MPO、LL-37等胞内和核内成分对机体免疫系统而言是潜在的自身抗原，也可造成肺组织损伤[17-18]，尤其是细胞外的组蛋白可直接损伤肺泡内皮细胞和上皮细胞[19]。此外，NETs中的补体成分C1q可进一步募集中性粒细胞至炎症病灶[20]，促使更多的NETs形成，从而形成炎症和损伤的恶性循环。因此，NETs也可能起到致病作用。已有研究证实，NETs在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等疾病中过度形成，与自身抗体形成有关[9]。本研究发现，CAP组外周血NETs水平较对照组明显增多，且重度CAP亚组外周血NETs水平显著高于轻度CAP亚组。LL-37是中性粒细胞的特异性抗原肽，其血清水平能够反映体内NETs的形成程度[6]。机体内残留的NETs是血浆cfDNA的主要来源之一，cfDNA亦能间接反映机体内NETs的形成情况[7]。为分析人体内NETs的形成情况，本研究通过进一步检测NETs的两个间接血清标志物LL-37和cfDNA水平发现，CAP组血浆LL-37和cfDNA水平显著高于对照组，且重度CAP亚组中的水平显著高于轻度CAP亚组。同时，血浆NETs荧光强度与LL-37及cfDNA水平均呈正相关。证实CAP患儿体内NETs形成增多，且机体NETs水平与CAP患儿病情严重程度有关。CRP、PCT等指标是反映CAP患儿机体炎症情况的重要指标[21]，本研究也证实CAP组CRP、WBC、PCT水平显著高于对照组，且血浆NETs水平与CRP、WBC、N%、PCT、TNF-α均呈正相关。因此推测，CAP患儿血清NETs水平的增高除与病原微生物感染有关外，也可能与CAP患儿体内炎性细胞因子的表达增加有关。及时清除NETs对预防疾病发生进展至关重要。有研究证实，DNaseⅠ可以降解胞外形成的NETs [8]。因此本研究进一步测定血浆中DNaseⅠ的活性以分析CAP患儿体内NETs不能有效降解的原因。结果发现，CAP组血浆DNaseⅠ活性显著低于对照组，提示DNaseⅠ活性在CAP患儿呈明显降低，且重度CAP患儿中降低更显著。因此推测，血浆DNaseⅠ的活性不足可能是导致血浆NETs不能有效降解的原因。
本研究进一步分析血清NETs及相关标志物对重度CAP患儿的诊断价值发现，NETs及相关标志物对鉴别儿童CAP病情严重程度有较高敏感度与特异度，在指导CAP治疗时具有一定参考意义。尽管NETs可杀伤病原微生物，但病原微生物感染也可引起CAP患儿体内促炎因子增多，从而造成异常NETs的形成。这些过度形成的NETs能够刺激浆细胞样细胞释放Ⅰ型干扰素，并进一步扰乱细胞因子网络[22]，从而导致恶性循环。CAP患儿体内过度形成的NETs不能被DNaseⅠ及时降解，残留的NETs可能会进一步破坏机体内环境稳态，导致病情进一步恶化。因此，体内NETs调节异常可能是儿童CAP发病的一个潜在因素，而DNaseⅠ可能成为新的治疗靶点。
综上所述，CAP患儿体内NETs形成能力显著增强，且降解NETs的能力显著降低，体内NETs的调节异常可能是CAP发病的潜在因素之一。血浆NETs及相关标志物水平对CAP及其病情严重程度具有一定诊断价值。然而，本研究未对NETs及相关标志物进行动态监测，且样本量较小，可能导致结果存在偏倚，在今后的工作中，会增加NETs的检测时间点和病例数、结合病理实验等做更为详尽的研究。
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