2020, Vol. 22
支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia, BPD）是早产儿中常见的慢性肺疾病（chronic lung disease, CLD）。尽管在过去的几十年中围产医学技术已得到飞速的发展，但BPD的发病率并没有显著下降，严重影响早产儿的存活率和生活质量[1]。目前更为常见的是一种“新型”BPD，主要病理特征是异常炎症反应刺激下引起晚期肺发育受阻，导致肺泡结构简单化和肺血管发育异常。肺发育是一个复杂的生物学过程，受到多种因素的影响与调节，包括糖皮质激素、催乳素和生长因子等[2-4]。而microRNAs（miRNAs）作为一类基因转录后调控其水平表达的非编码RNA，主要作用是通过促进mRNA降解或干扰mRNA翻译来抑制基因翻译。近年来，越来越多的研究发现miRNAs在包括肺发育在内的多种生物学过程中具有重要作用[5]。目前已有多种miRNAs被报道与肺发育过程密切相关，包括miRNA-127、miRNA-26a、miRNA-106b等[6-8]。但是，随着对肺发育及肺发育相关疾病机制理解的加深，更多有意义的miRNAs尚待发现和研究。
miRNA-495作为miRNAs中的一员，被报道参与调控细胞发育、凋亡、免疫及炎症反应，并与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和耐药有关[9]。Yang等[10]研究发现miRNA-495在肺发育中具有重要的作用，可能参与调控肺发育的不同阶段。因此，本研究推测miRNA-495可能与肺发育及肺发育相关疾病密切相关。本文基于生物信息学分析，探讨miRNA-495-5p在早产儿BPD中的表达及其临床意义，为研究miRNA-495-5p在BPD发生发展中的作用提供功能与机制的线索。
1 资料与方法 1.1 观察对象2015年1月至2016年12月收集在本院NICU住院治疗的早产儿的一般临床资料。BPD的早期症状通常表现为在机械通气过程中出现呼吸机依赖或停氧困难超过10~14 d[11]。结合目前国内外BPD的诊断标准[11]，本研究中BPD组患儿纳入标准为在机械通气过程中出现呼吸机依赖，或鼻导管吸氧过程中停氧困难超过28 d，具有早产儿BPD早期临床表现（共20例；其中14例行机械通气，6例行空气、氧气混合鼻导管吸氧）。对照组早产儿无用氧史或无长时间用氧史，没有早期BPD临床表现（共20例；均行空气、氧气混合鼻导管吸氧，吸入氧浓度＜30%，用氧时间＜3 d）。BPD组患儿胎龄28.8±4.3周，出生体重1 570±335 g；对照组患儿胎龄29.1±2.5周，出生体重1 620±289 g。所有入组患儿的基础疾病均为早产儿或伴有新生儿呼吸窘迫综合征，均无围生期感染，入院时间均在生后12 h以内。采集末梢外周血时间，BPD组患儿为用氧28 d以后，对照组患儿为生后3 d左右。两组患儿的一般临床资料进行比较差异无统计学意义（P > 0.05）。本研究经伦理委员会批准并家属签属知情同意。
1.2 miRNA芯片使用TRIzol法提取血清RNA，使用NanoDrop ND-1000测量纯化后的RNA浓度，电泳检测RNA完整性。抽提的RNA通过质检后，使用miRCURYTMArray Power Labeling Kit（Cat #208032-A，丹麦Exiqon公司）对miRNA进行标记；然后将样品与miRCURYTM LNA Array（v.18.0，丹麦Exiqon公司）芯片杂交，实验方法参照说明书进行。最后使用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片。
1.3 RT-PCR检测提取血清总RNA后，参考逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，获得cDNA样品。由上海康成生物有限公司设计并合成目的基因及内参基因的引物序列（表 1）。RT-PCR反应体系：2×MasterMix 5 µL，10 µmol/L上、下游引物各0.5 µL，cDNA模板2 µL，DEPC水2 µL。于RT-PCR仪上进行PCR反应：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 60 s，40个循环；扩增反应结束后，95℃ 10 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，并从60℃缓慢加热到95℃（仪器自动进行，速度为0.075℃/s）。最终数据采用2-△△Ct方法计算并表示。
| 表 1 PCR引物序列 |
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利用miRNA靶标基因数据库TargetScan、miRDB、miRWalk进行靶基因预测，得到有关miRNA-495-5p的靶基因，取此3种软件预测结果的交集作为差异miRNA的最终靶基因。
1.5 Gene Ontology分析Gene Ontology（GO）分析针对靶基因进行功能富集分析，包含GO注释中的分子功能（molecular function）、生物学过程（biological process）及细胞组分（cellular component）。
1.6 统计学分析miRNA芯片扫描图输入GenePix Pro6.0软件中进行数据分析，使用差异倍数（fold change）和P值筛选差异性表达的miRNA。将PCR数据结果录入GraphPad Prism软件中，呈正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用两样本t检验。利用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对靶基因进行KEGG信号转导通路富集分析及GO分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 miRNA芯片及RT-PCR验证结果随机选取两组各5例患儿血清样本行miRNA芯片筛查，BPD组胎龄29.8±2.1周，出生体重1 386±285 g，对照组胎龄30.9±1.8周，出生体重1 467±101 g，两组患儿胎龄及出生体重比较差异均无统计学意义（分别t=-0.93、-0.60，P > 0.05）；miRNA芯片结果显示，与对照组患儿（0.21±0.06）相比，BPD组患儿血清miRNA-495-5p（0.41±0.17）表达上调（t=2.44，P＜0.05），差异表达倍数（BPD组/对照组）为1.92。
随机选取两组各6例患儿血清样本行RT-PCR检测，BPD组胎龄29.6±1.9周，出生体重1 296±330 g，对照组胎龄31.4±1.8周，出生体重1 507±127 g，两组患儿胎龄及出生体重比较差异均无统计学意义（分别t=-1.73、-1.46，P > 0.05）；RT-PCR结果显示，BPD组患儿miRNA-495-5p表达水平（2.56±0.83）高于对照组（1.05±0.35）（t=3.77，P＜0.05），与芯片结果一致。
2.2 靶基因预测结果利用miRNA靶标基因数据库TargetScan、miRDB、miRWalk进行靶基因预测并取交集，结果得到miRNA-495-5p的靶基因共117个，其中部分靶基因见表 2。
| 表 2 miRNA-495-5p经3个软件预测所得的靶基因交集 |
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以上117个靶基因通过GO注释描述共得到55个基因的GO生物学过程注释信息、27个基因的GO分子功能注释信息及23个基因的GO细胞组分注释信息。结果显示miRNA-495-5p的预测靶基因分别富集在代谢过程的调控、依赖DNA的转录调控、血管模式等生物学过程，转录调节活性、转录激活活性、转录辅助激活活性等分子功能，以及核质、模组分、不溶性组分等细胞组分上（P＜0.05），见表 3~5。
| 表 3 miRNA-495-5p预测靶基因GO生物学过程分类 |
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| 表 4 miRNA-495-5p预测靶基因GO分子功能分类 |
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| 表 5 miRNA-495-5p预测靶基因GO细胞组分分类 |
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在GO注释分类的基础上，利用已有生物通路数据，对基因集合中的117个基因进行生物通路富集分析。结果显示，miRNA-495-5p显著富集于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路中（P＜0.05），见表 6。
| 表 6 miRNA-495-5p预测靶基因的KEGG通路数据库富集分析 |
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早产儿肺发育不成熟，而BPD的本质是各种因素对不成熟肺导致的肺损伤，及损伤后的异常修复。目前BPD作为影响早产儿存活率及预后的常见CLD，已成为新生儿重症监护病房最为棘手的问题之一，但确切机制尚未完全阐明。因此，探讨BPD的发病机制及防治措施具有重大的临床意义。
miRNAs是约含22个核苷酸的高度保守的非编码小分子RNA，通过对靶基因的转录后调控，改变靶蛋白的表达水平，最终影响多种生理和病理过程，与生物体发育、细胞增殖、分化和凋亡、肿瘤发生发展及炎性反应等生物学过程密切相关[12]。近年来，多项研究结果表明miRNAs在肺发育及肺发育相关疾病中具有重要作用。本研究采用miRNA芯片技术筛选在BPD患儿血清中差异性表达的miRNAs，并利用RT-PCR技术确定其差异性表达，拟从miRNA的角度探讨BPD的发病机制。结果表明，相比于对照组患儿，BPD组患儿血清miRNA-495-5p表达上升，差异有统计学意义。进一步查阅文献可知，在胎肺发育过程中，miRNA-495在小管期向囊泡期发育的过程中表达上升，而在随后的囊泡期向肺泡期发育过程中表达下降，提示miRNA-495的表达变化可能参与调控肺发育的不同阶段[10]。据此，本研究推测miRNA-495与肺发育密切相关，并可能促进BPD的发病。目前已有研究报道miRNA-495表达变化与肺癌、慢性哮喘、缺血后新生血管形成等疾病有关，但其在BPD中的功能及机制尚未见相关报道[13-15]。
本研究中GO分析可见miRNA-495-5p靶基因集合功能富集于转录调节活性、转录激活活性等分子功能，代谢过程调控、依赖DNA的转录调控等生物学过程，以及核质、模组分等细胞组分上，以上结果均提示miRNA-495-5p在新生血管生成、干细胞分化等细胞器官发育过程中发挥着重要作用，这可能是miRNA-495-5p参与调控肺发育不同阶段的重要作用机制。值得注意的是，作为一类具有自我更新及多向分化潜能的细胞，干细胞是参与器官损伤后组织修复再生的主要外源干细胞之一。目前已有大量的体内外实验证明骨髓间充质干细胞可通过增加肺上皮细胞的数量，减轻肺上皮细胞损伤并修复功能障碍[16-18]，这可能作为miRNA-495-5p参与调控BPD等肺发育相关疾病的重要作用机制，并为BPD的防治提供新的思路。
mTOR是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属磷脂酰肌醇激酶相关激酶家族，主要调控细胞生长、增殖、凋亡和自噬，与心血管疾病、葡萄糖和脂质代谢相关疾病及自身免疫性疾病等密切相关[19]。本研究在GO注释分类的基础上对集合基因进行生物通路富集分析，结果显示miRNA-495-5p显著富集于mTOR信号通路中。特异性阻断P13K/mTOR信号通路可抑制体外血管内皮生长因子（VEGF）诱导的细胞增殖、生存和体内VEGF诱导的血管生成[20]。已有报道称miRNA-495可通过mTOR信号通路促进软骨细胞凋亡、衰老及导致骨关节炎的进展[9]；参与调节胃癌细胞的凋亡及转移，增加胃癌对化疗药物的敏感性等[21]。以上研究结果提示miRNA-495-5p可能通过调节mTOR信号通路活性参与肺发育不同阶段的细胞增殖、凋亡及血管生成等生物学过程。Sureshbabu等[22]进一步发现在高氧环境中抑制mTOR可限制自噬性肺损伤，减少细胞凋亡的发生，改善肺组织结构，增加小鼠存活率。这可能是miRNA-495-5p促进BPD发生发展的重要作用机制，即miRNA-495-5p可能通过激活mTOR信号通路导致肺部异常炎症反应，促进BPD的发生发展。
综上所述，本研究应用生物信息学方法对miRNA-495-5p进行系统性描述，结果显示miRNA-495-5p在BPD发生发展过程中可能发挥着重要作用，且有可能是通过调控新生血管生成、干细胞分化、细胞凋亡及自噬等方面实现的。但本研究尚未在细胞水平及体内实验进行相关验证，缺乏相关实验数据支持，故应谨慎对待。本研究的推论或为今后miRNA-495-5p与BPD相关性研究提供一定的数据支持和理论指导。
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