宫内生长受限（intrauterine growth restriction, IUGR）是指基于种族和性别，胎儿未能到达其期望的生长潜能^[1]。目前认为，IUGR和许多代谢性疾病有关，包括2型糖尿病、血脂异常和代谢综合征等^[2]。前期研究发现IUGR大鼠在成年后更易出现肝脏脂肪堆积，这和IUGR大鼠脂肪酸代谢途径中相关基因的调节紊乱有关^[3]。近年来，绿茶中所含的表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate, EGCG）对非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver, NAFLD）的改善作用被广泛地研究^[4]。然而，EGCG是否能够防治IUGR子代肝脏脂肪变性的发生，这还并不清楚。脂肪酸的从头合成和β氧化通路异常是NAFLD发病机制中的重要环节之一。Srebf1是脂肪酸从头合成调节通路中的关键基因，受多个上游基因的调控，包括Ampk、Pparg、Irs、Adipor等，这些基因和能量代谢及胰岛素抵抗密切相关；而Cpt1a是脂肪酸β氧化的关键基因，受到Ppara、Ppargc1a等的调节，对肝脏脂肪酸的代谢起到重要的调节作用^[5-6]。当前研究探索EGCG对IUGR子代肝脏脂代谢的影响，并在转录水平上了解脂肪酸合成和氧化相关基因的表达变化，以期为IUGR导致的脂代谢紊乱的防治提供指导。

本研究采用孕期全程限食法（进食量为正常孕鼠前1日进食量的50%）建立IUGR大鼠模型。该模型是IUGR的经典动物模型之一，操作简便，成功率高，许多代谢相关性研究均采用该模型^[7-8]。选取未曾交配的雄性和雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重250~300 g，经过1周的适应性喂养，以雌雄2 : 1的比例进行交配，妊娠第0天定义为阴道涂片中出现精子当天。雌鼠怀孕后，随机分为正常组（n=8）和限食组（n=8）。仔鼠出生后，所有母鼠均不限制饮食，且新生仔鼠由其母鼠喂养。为避免哺乳条件不同造成的差异，生后将每笼子鼠数量调整为8只。

考虑到性别和性激素对脂代谢的影响，本研究只采用雄性仔鼠进行后续实验。离乳后，正常组从每只母鼠分娩的仔鼠中随机取1只雄性仔鼠作为对照组（n=8）；限食组从每只母鼠分娩的仔鼠中随机取2只雄性子鼠，再随机分配到IUGR组（n=8，正常饮水）和EGCG组（n=8，生后第21天起，给予含0.25 mg/mL EGCG的水饮用，直至第10周，之后改为正常饮水），以减少组间母体和遗传因素影响。在生后第13周，经过12 h禁食，用血糖仪测量大鼠尾静脉血糖值后，腹腔内注射10%水合氯醛麻醉，采集血液和肝脏标本。

出生时和出生后每周于清晨测量1次大鼠体重。断奶后，于每日清晨供给新鲜的饮水，并于次日晨丢弃剩余饮水。饮水量每周测定1次，定义为（供给水量-剩余水量）×100/体重，即为每日每100 g体重的饮水量。

将采集的血液标本离心后收集上清，然后使用总胆固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglycerides, TG）、胰岛素、游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）诊断试剂盒来测定样本的指标水平。使用公式计算稳态模型评估胰岛素抵抗（homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR）和脂肪组织胰岛素抵抗（adipose tissue insulin resistance, adipo-IR），即HOMA-IR=空腹血糖（fasting plasma glucose, FPG）×空腹胰岛素（fasting insulin, FINS）/22.5，adipo-IR= FFA×FINS。根据试剂盒说明书，测定肝脏TG和TC的含量。对肝脏组织冰冻切片行油红染色后，显微镜下观察肝细胞脂肪变性情况。

提取肝脏组织的总RNA，使用超微量分光光度计测定其浓度和纯度。经鉴定合格后，取1 µg的总RNA样本，经逆转录得到单链cDNA。使用Primer Premier 6和Oligo 7进行引物设计并验证，实验中采用的引物序列和产物长度列于表 1。采用管家基因β-actin作为内参基因。PCR反应体系：2×SYBR Green Master Mix 5 µL，上、下游引物各0.2 µL，cDNA模板0.5 µL，RNA-free水4.1 µL。混匀后3 000 r/min离心2 min，置于实时荧光定量PCR系统上进行扩增反应，反应条件：50℃激活2 min，95℃激活2 min；95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸1 min，循环40次。分析目的基因相对表达量时，使用2^-ΔΔCt法进行数据分析。

表 1 Table 1

表 1 引物序列和产物长度

表 1 引物序列和产物长度 基因 序列 产物长度 β-actin 5'-AGGCTGTGTTGTCCCTGTATG-3' 203 bp 5'-AGCTGTGGTGGTGAAGCTGTA-3' Ampk 5'-GGCGTGTGAAGATCGGACA-3' 235 bp 5'-GTTGGAGTGCTGATCACTTGG-3' Adipor1 5'-GGTGGTCTTCGGGATGTTCTT-3' 213 bp 5'-ATGGAGAGGTAGATGAGCCGT-3' Adipor2 5'-TACACACAGAGACGGGCAAC-3' 194 bp 5'-GCAGTACACCGTGTGGAAGA-3' Irs1 5'-GTGGCCAGCCAGGCTATTTA-3' 111 bp 5'-ACTCTTCCGAGCCAGTCTCT-3' Irs2 5'-GCCACCGTGGTGAAAGAGTA-3' 103 bp 5'-AGCGTTGGTTGGAAACATGC-3' Nr1h3 5'-CCAGGATGCCCCAATCAACT-3' 236 bp 5'-GAAGAATCCCTTGCAGCCCT-3' Ppargc1a 5'-GACATGTGCAGCCAAGACTC-3' 213 bp 5'-TATGTTCGCGGGCTCATTGT-3' Ppara 5'-GTCCCTCGGAGAGGAGAGTT-3' 170 bp 5'-TGCCAGGGGACTCATCTGTA-3' Pparg 5'-CTGCGTCCCCGCCTTATTAT-3' 293 bp 5'-GGCATTGTGAGACATCCCCA-3' Srebf1 5'-CGCTCTTGACCGACATCGAA-3' 110 bp 5'-GCCTGTGTCTCCTGTCTCAC-3' Cpt1a 5'-CCCTGTGAATACTTGGGCGT-3' 275 bp 5'-ATGGGCCCCTTCTTTAAGGC-3'

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计学分析。符合正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比较采用两独立样本t检验；多组间均数比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q法。不符合正态分布计量资料以中位数（四分位间距）[M（P₂₅, P₇₅）]表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用Dunn法。P < 0.05为差异有统计学意义。

出生时，正常大鼠的体重为6.7±0.6 g，IUGR大鼠为5.8±0.6 g，两者出生体重比较差异有统计学意义（t=10.206，P < 0.001）。出生后，各组大鼠的生长曲线见图 1。生后第13周，对照组大鼠体重为385±22 g，IUGR组大鼠为359±21 g，EGCG组大鼠为367±21 g，各组间的体重比较差异无统计学意义（F=3.085，P=0.067）。此外，方差分析结果显示，各个时间点三组间饮水量的比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。

图 1 各组大鼠生后1~13周的生长曲线

三组大鼠的FPG水平比较差异有统计学意义（P < 0.05），IUGR组大鼠的FPG水平较对照组升高，且离乳后EGCG干预能够降低IUGR大鼠的FPG至正常水平（P > 0.05）。三组之间的血清TG、TC水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）；但是肝脏组织的TG和TC水平比较差异有统计学意义（P < 0.05），与对照组大鼠比较，IUGR组的肝脏TG和TC水平有升高，但差异未达到统计学意义（P > 0.05），与IUGR组大鼠比较，EGCG组的肝脏TG和TC水平明显下降（P < 0.05），且与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。三组之间FFA、FINS、HOMA-IR和adipo-IR水平比较差异有统计学意义（P < 0.001）。与对照组相比，IUGR组大鼠FFA、FINS及adipo-IR水平明显升高，EGCG能降低其水平，但仍高于对照组（P < 0.05）。IUGR组大鼠HOMA-IR水平高于对照组，EGCG组的HOMA-IR水平低于IUGR组（P < 0.05），且与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。油红染色结果显示，与对照组大鼠相比，IUGR大鼠的肝脏呈现明显的脂肪变性，而EGCG能够减少肝细胞的脂肪储积，见图 2。

表 2 Table 2

表 2 各组血清生化指标和肝脏脂质水平比较

表 2 各组血清生化指标和肝脏脂质水平比较  [x±s或M(P25, P75)] 组别 n FPG (mmol/L) 血清TG (mmol/L) 血清TC (mmol/L) FFA (mmol/L) FINS (mIU/L) HOMA-IR adipo-IR 肝脏TG (μg/mg) 肝脏TC (μg/mg) 对照组 8 3.6±0.3 0.42±0.14 1.39±0.30 0.68±0.11 26±4 4.2±0.9 17±4 12.9(8.8, 13.9) 3.4±1.0 IUGR组 8 4.2±0.7a 0.54±0.21 1.12±0.31 1.38±0.11a 53±4a 9.9±1.4a 74±8a 15.9(11.3, 21.0) 4.1±0.8 EGCG组 8 3.6±0.4 0.49±0.11 1.17±0.13 1.00±0.11a, b 34±9a, b 5.3±1.3b 34±10a, b 9.8(8.3, 11.2)b 2.9±0.6b F/H值 3.985 1.066 2.357 79.268 41.312 49.209 111.975 6.664 4.581 P值 0.034 0.362 0.119 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.036 0.022   注：[FPG]空腹血糖；[TG]甘油三酯；[TC]总胆固醇；[FFA]游离脂肪酸；[FINS]空腹胰岛素；[HOMA-IR]稳态模型评估胰岛素抵抗；[adipo-IR]脂肪组织胰岛素抵抗。a示与对照组比较，P < 0.05，b示与IUGR组比较，P < 0.05。

图 2 各组大鼠在生后13周时的肝脏组织病理切片（油红染色） 与对照组大鼠相比，IUGR组大鼠的肝细胞出现明显的脂肪变性（低倍镜下示肝组织油红染色面积增大，高倍镜下示肝细胞内染色脂滴体积增大），而经EGCG干预后的IUGR大鼠肝脏脂肪颗粒体积和数量均有减少。

三组之间Ampk、Adipor1、Irs2和Srebf1的mRNA表达水平比较差异有统计学意义（P < 0.05）。与对照组相比，IUGR组的Ampk mRNA及Adipor1 mRNA水平均降低，Srebf1 mRNA水平增加（P < 0.05）；EGCG组与对照组比较，Ampk mRNA及Srebf1 mRNA水平差异均无统计学意义（P > 0.05）；EGCG组与IUGR组比较，Adipor1 mRNA水平差异无统计学意义（P > 0.05）。与对照组比较，IUGR组大鼠的Irs2 mRNA水平虽然没有降低（P > 0.05），但是EGCG能提高其表达水平（P < 0.05）。脂肪酸氧化相关基因（Ppara、Ppargc1a和Cpt1a）的mRNA水平，以及Adipor2、Pparg、Irs1和Nr1h3的mRNA水平在各组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 3。

表 3 Table 3

表 3 各组肝脏相关基因的mRNA水平比较

表 3 各组肝脏相关基因的mRNA水平比较  [x±s或M(P25, P75)] 组别 n Ampk Adipor1 Adipor2 Irs1 Irs2 Nr1h3 Ppargc1a Ppara Pparg Srebf1 Cpt1a 对照组 8 1.00±0.38 1.00±0.49 1.00±0.30 0.15(0.09, 0.30) 1.00±0.93 1.00±0.46 0.64(0.48, 1.63) 1.00±0.97 1.00±0.82 1.00±0.27 1.00±0.56 IUGR组 8 0.50±0.26a 0.55±0.31a 0.75±0.40 0.17(0.13, 0.24) 1.00±0.40 0.60±0.27 0.97(0.83, 1.18) 0.59±0.37 1.03±0.76 1.65±0.51a 0.72±0.41 EGCG组 8 0.68±0.36 0.55±0.31a 0.81±0.40 0.32(0.12, 0.77) 2.94±2.55a, b 0.71±0.34 1.98(0.92, 5.61) 0.50±0.37 0.63±0.55 1.35±0.57 0.77±0.83 F/H值 4.431 3.716 0.979 0.720 3.997 2.537 4.055 1.396 0.780 3.807 0.472 P值 0.025 0.042 0.392 0.698 0.034 0.103 0.132 0.270 0.471 0.039 0.630   注：a示与对照组比较，P < 0.05，b示与IUGR组比较，P < 0.05。

本研究的主要发现是EGCG能够改善IUGR诱导的肝脏脂肪储积，这可能是由于EGCG可导致肝脏细胞的Ampk mRNA表达增加，从而抑制Srebf1 mRNA的表达，减少肝脏脂肪酸的从头合成。此外，本研究还发现，EGCG能够显著改善IUGR大鼠的胰岛素抵抗。

临床研究发现，虽然IUGR子代出生时表现为体重降低，但是大部分会在生后早期出现追赶生长^[9]。这和本研究结果相似，虽然出生时IUGR大鼠体重明显降低，但至生后13周时，其和正常大鼠的体重比较差异已无统计学意义，表明有出现追赶生长。但是，IUGR大鼠在成年早期就已经出现了肝脏的脂质代谢紊乱，包括TG和TC的水平升高，且病理学检查也发现肝细胞出现了脂肪的积累。这个和Niu等^[10]的研究结果类似，他们在IUGR大鼠的肝脏组织也发现了TG水平的升高，进一步的PCR结果显示IUGR的Ampk mRNA水平降低而Srebf1 mRNA水平升高。AMPK在脂代谢中发挥着重要的作用，AMPK的激活能够降低脂肪酸的从头合成、增加脂肪酸氧化及改善胰岛素抵抗^[11]。AMPK作为多个代谢路径的重要调节因子，是代谢相关性疾病的重要治疗靶点之一^[12]。IUGR大鼠的Ampk mRNA表达降低，继而减少对Srebf1 mRNA的抑制，增加肝脏的脂肪酸从头合成，导致脂肪在肝脏的堆积。

本研究发现，离乳后的EGCG干预能够改善肝脏的脂肪堆积。目前认为，EGCG的作用机制之一是通过激活AMPK而引起下游一系列改善脂代谢的效应^[13]。与此相应，我们也发现离乳后EGCG摄入能够增加IUGR大鼠的Ampk mRNA水平。Li等^[14]对高脂饮食喂养的小鼠研究发现，在皮下和附睾脂肪组织，EGCG喂养的小鼠AMPK活性明显增加。Srebf1是脂肪酸合成路径中的重要调控基因，能够增加脂肪酸合成酶等相关基因表达，增加肝脏细胞的脂肪酸从头合成^[15-16]。EGCG干预的IUGR大鼠Srebf1 mRNA水平降低，可能是通过EGCG增加Ampk mRNA表达介导的。

胰岛素抵抗是非酒精性脂肪肝病的关键环节之一。IUGR子代的空腹FFA和胰岛素水平明显升高，且反映胰岛素抵抗水平的两个指标HOMA-IR和adipo-IR也均升高，提示IUGR大鼠存在明显的胰岛素抵抗。蛋白组学的研究发现，肝脏中代谢相关的关键激素和酶的改变可能是IUGR猪在成年后更容易发生胰岛素抵抗的原因^[17]。本研究发现IUGR大鼠肝脏的Adipor1 mRNA表达较对照组降低近一半，这可能会导致肝脏对脂联素的反应性降低，从而降低胰岛素敏感度，遗憾的是，EGCG并不能上调Adipor1 mRNA的表达。虽然如此，本研究还是发现离乳后的EGCG干预能够改善胰岛素抵抗相关指标，这可能和EGCG上调Irs2 mRNA的表达有关系。

综上所述，本研究发现早期EGCG干预可能通过Ampk/Srebf1通路下调脂肪酸的从头合成，并通过改善肝细胞的胰岛素抵抗，从而降低IUGR大鼠的肝脏脂肪积累。