2020, Vol. 22
2. 湖南省儿童医院心胸外科, 湖南 长沙 410078
先天性心脏病（congenital heart disease, CHD）是最常见的出生缺陷，全球范围内CHD的发病率为9‰[1]。CHD病因复杂，目前认为是环境和遗传因素共同作用的结果。多项前瞻性队列研究表明，母亲患糖尿病，包括孕前糖尿病和妊娠期糖尿病，是CHD发病的重要环境因素，且几乎与所有CHD亚型相关[2-5]。研究发现高氧化应激水平是糖尿病发生的重要原因[6]。动物实验发现孕前糖尿病鼠胎心脏内也存在高氧化应激水平[7]，且发现给予孕前糖尿病小鼠抗氧化剂以降低氧化应激水平，其胎鼠CHD的发生率显著减低[8]，这提示孕前糖尿病时高氧化应激水平是导致心脏畸形的重要原因[6]。解偶联蛋白2（uncoupling protein 2, UCP2）是线粒体内膜上解偶联蛋白家族成员之一，参与调控细胞内过氧化物质的生成[9-10]。过氧化物质能通过各种机制作用于胚胎和机体[6, 11-12]，影响胚胎发育和相关疾病的发生发展。研究表明UCP2基因多态性能增加胎儿神经管畸形和2型糖尿病的风险[13-15]，但与CHD的关系的研究尚未见报道。基于以上背景，本研究采用病例对照研究，探讨母亲糖尿病、UCP2基因多态性及两者交互作用与子代CHD的关系，以期为CHD的病因研究提供新的线索。
1 资料与方法 1.1 研究对象采用以医院为基础的病例对照研究，选择2018年3月至2019年8月在湖南省儿童医院心胸外科确诊住院的464例0~1岁单纯CHD（指不伴有其他器官畸形）患儿的母亲为病例组。其中所诊断的CHD的具体亚型包括：室间隔缺损（336例）、动脉导管未闭（130例）、房间隔缺损（128例）和房室隔缺损（50例）。选择同期因感冒、腹泻、外伤等就诊于同一所医院的504例0~1岁儿童的母亲为对照组，对照组儿童经询问病史，临床检查排除CHD及其他出生缺陷。所有研究对象均为汉族。本研究已获中南大学湘雅公共卫生学院伦理委员会审批并进行了临床试验注册（伦理审批号：XYGW-2018-07；注册号：ChiCTR1800016635）。参与本研究的研究对象均签署了知情同意书。
1.2 问卷调查本研究使用统一的问卷调查表，所有调查员经过统一培训，以访谈的形式对研究对象进行流行病学问卷调查。调查内容包括研究对象糖尿病暴露史和基本情况。其中糖尿病暴露史部分的调查包括询问本次怀孕妊娠期和孕前糖尿病患病情况及既往有无妊娠糖尿病史。为防止回忆偏倚，本研究结合孕母妇幼保健手册，以进一步确认母亲糖尿病暴露信息。研究对象的基本情况部分调查包括：研究对象基本社会人口学特征（孕龄、文化程度、孕前体重指数、家庭年收入、居住地等）、家族成员出生缺陷史、个人既往先天畸形史、三代以内近亲结婚家族史、孕前及孕早期叶酸补充情况、孕早期感冒和发烧史、孕前3个月及孕早期生活方式（主动吸烟、二手烟暴露、饮酒史、饮茶史、喝咖啡史等）、孕前3个月及孕早期环境有害物质暴露情况（化妆品使用、居住点周围工厂环境有害污染物排放、居住地周围公路或交通干道噪声、染发烫发、居室装修、宠物喂养）和孕前3个月及孕早期饮食习惯（腌制食品、烧烤或油炸食品、鲜肉、鱼虾、蔬菜、新鲜水果、新鲜鸡蛋、大豆及豆制品和奶制品的摄入频率）等。此外，本研究也收集研究对象配偶的年龄、饮酒史、吸烟史等基本情况。
1.3 DNA的提取和基因多态性检测（1）DNA提取：抽取两组研究对象5 mL静脉血放入EDTA抗凝管，3 000 r/min离心15 min以分离血浆和血细胞，分装血浆和血细胞，将血细胞置于-80℃冰箱中低温保存备用。采用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen, Valencia, CA, USA）提取血细胞中的DNA，用紫外分光光度计测定DNA溶液的浓度和纯度。
（2）基因多态性检测：通过查阅文献筛选与糖尿病有关的UCP2基因热点突变位点。本研究选取3个热点突变位点（分别为rs659366、rs660339、rs591758）作为研究候选位点[13-14]。应用MassARRAY飞行时间质谱对3个位点的单核苷酸多态性（SNP）进行检测，具体检测工作由博淼生物科技（北京）有限公司完成。其中聚合酶链反应引物、循环条件和预期产物的大小参考既往文献[13-14]。
1.4 统计学分析采用EpiData3.1软件建立数据库。应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，以P < 0.05为差异具有统计学意义。计数资料采用例数和构成比或率（%）表示。二分类变量采用χ2检验或者Fisher精确概率检验，有序多分类变量采用Wilcoxon秩和检验。在描述比较基因多态性位点基因型分布频率之前，对对照组人群进行Hardy-Weinberg平衡检验，P≥0.05则说明各基因频率达到遗传平衡。采用单因素和多因素logistic回归分析，分别计算未调整和调整的相对危险比（OR）及95%可信区间（CI），并控制潜在的混杂因素，以检验母亲糖尿病暴露、UCP2基因多态性与CHD的关联强度。采用logistic回归模型对UCP2基因和母亲糖尿病暴露间可能存在的交互作用进行定性判断和定量分析及显著性检验。在模型中，将诊断组（病例组vs对照组）设为因变量（二元结果），将相应的混杂因素、母亲糖尿病史、UCP2基因的基因型、基因与糖尿病的相互作用设为自变量（协变量），通过logistic回归分析计算调整的OR。使用交互系数（γ）确定变量间是否存在相加交互作用。γ值通过logistic回归分析的回归系数（β）计算获得，计算方法如下：γ1=βe*g/βe，γ2=βe*g/βg。其中，βe和βg分别表示仅有母亲糖尿病暴露存在和仅有UCP2基因SNP存在时的回归系数，βe*g表示UCP2基因SNP和母亲糖尿病暴露同时存在时的回归系数。当两个γ值均大于1且交互项回归系数P < 0.05时，表明基因对糖尿病的效应有放大作用，存在正交互作用，即两因素同时存在时效应增强；当两个γ值小于1且交互项回归系数P < 0.05时，表明基因对糖尿病的效应有减弱作用，存在负交互作用，即两因素同时存在时效应减弱；当γ值等于1时，表明两因素之间不存在交互作用。
2 结果 2.1 两组基线资料的比较表 1显示，孕母文化程度、家庭年收入、居住地、家族成员出生缺陷史、家族三代近亲结婚史、孕前3个月及孕早期叶酸补充情况、孕早期感冒发烧、孕前3个月及孕早期生活方式（主动吸烟、二手烟暴露、饮酒、饮茶、喝咖啡）、孕前3个月及孕早期环境有害物质接触（化妆品使用、居住地附近环境有害污染物排放、居住地靠近公路或交通干道、喂养宠物和染发烫发）、孕前3个月及孕早期饮食习惯（烧烤或油炸食品、鱼虾、新鲜蛋类、新鲜水果、豆类食品和奶制品的摄入频率）、配偶文化程度、配偶吸烟史和配偶饮酒史在两组的比较差异有统计学意义（P < 0.05）。这些差异有统计学意义的因素将作为后续多因素分析的混杂因素进行控制。
| 表 1 对照组和病例组的基线资料比较 |
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单因素分析显示，本次妊娠是否患妊娠期糖尿病（χ2=16.018，P < 0.001）、既往妊娠是否患妊娠期糖尿病（χ2=14.082，P < 0.001）和本次妊娠前是否患糖尿病（χ2=28.414，P < 0.001）的分布频率在病例组和对照组间差异有统计学意义。调整表 1基线资料比较中差异有统计学意义的混杂因素后，多因素logistic回归分析结果显示，本次妊娠患妊娠期糖尿病（OR=2.96，95%CI：1.57~5.59）、既往妊娠患妊娠期糖尿病（OR=3.16，95%CI：1.59~6.28）和本次妊娠前患糖尿病（OR=4.52，95%CI：2.41~8.50）均显著增加子代CHD的风险。见表 2。
| 表 2 母亲糖尿病与子代CHD关联的分析 |
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Hardy-Weinberg平衡检验显示，对照人群UCP2基因3个位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（均P > 0.05）（表 3）。
| 表 3 对照组UCP2基因型Hardy-Weinberg平衡检验 |
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单因素分析显示，UCP2基因两个位点rs659366和rs660339的基因型分布频率在病例组和对照组间差异均有统计学意义（P < 0.001）。多因素logistic回归分析显示，在调整表 1基线资料比较中差异有统计学意义的混杂因素后，在位点rs659366上，携带T/C（OR=1.49，95%CI：1.02~2.16）或T/T（OR=2.77，95%CI：1.67~4.62）基因型的母亲与携带C/C基因型比较，子代CHD的风险显著增加（P < 0.05）；在位点rs660339上，携带A/A（OR=2.19，95%CI：1.34~3.58）基因型的母亲与携带G/G基因型比较也显著增加子代CHD的风险（P < 0.05）。见表 4。
| 表 4 母亲UCP2基因型频率分布与CHD的关系 |
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交互作用结果显示，在调整表 1基线资料比较中差异有统计学意义的混杂因素后，携带rs659366位点T/T基因型的母亲，如果既往妊娠患妊娠期糖尿病（OR=8.56，95%CI：2.10~34.80）、本次妊娠前患糖尿病（OR=8.68，95%CI：7.72~31.92）将显著增加子代CHD发生的风险（P < 0.05）；而携带T/C基因型的母亲，如果本次妊娠患妊娠期糖尿病（OR=7.50，95%CI：2.41~23.40）、既往妊娠患妊娠期糖尿病（OR=5.34，95%CI：1.58~18.11）、本次妊娠前患糖尿病（OR=4.77，95%CI：1.67~13.63）将显著增加子代CHD发生的风险（P < 0.05）。见表 5。
| 表 5 母亲糖尿病与UCP2基因rs659366多态性对子代CHD发病的交互作用 |
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携带rs660339位点G/A基因型的母亲，如果本次妊娠患有妊娠期糖尿病（OR=6.75，95%CI：2.23~20.41）、本次妊娠前患糖尿病（OR=3.25，95%CI：1.12~9.46）将显著增加子代CHD发生的风险（P < 0.05），见表 6。
| 表 6 母亲糖尿病与UCP2基因rs660339多态性对子代CHD发病的交互作用 |
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本研究显示，本次妊娠前患有糖尿病（OR=4.52）及本次妊娠患妊娠期糖尿病（OR=2.96）的母亲，其子代发生CHD的风险明显增高，与既往研究结果一致，如来自美国[2]、挪威[3]、加拿大[4]和丹麦[5]的队列研究和一项最新的Meta分析[16]表明，孕前糖尿病和妊娠期糖尿病会增加子代总CHD及亚型CHD的发病风险。其可能的机制为：胎儿心脏发育的关键阶段是妊娠3~8周，妊娠早期宫内环境维持的高血糖状态[16]和高氧化应激水平[6-7]，可能导致胚胎心脏发育异常。妊娠期糖尿病通常在孕24~28周确诊，虽已错过胎儿心脏发育的关键时期，但研究显示其仍能增加子代CHD的发病风险[2]，关于妊娠期糖尿病导致CHD的发病机制较为复杂，其具体机制还有待进一步研究。
本研究还发现，UCP2基因两个位点（rs659366和rs660339）的多态性与子代CHD发病存在关联。例如，在rs659366上，携带T/T或T/C基因型的母亲其子代发生CHD的风险分别是携带C/C基因型母亲的2.77倍和1.49倍；在rs660339上，携带A/A基因型的母亲其子代发生CHD的风险是携带G/G基因型母亲的2.19倍。UCP2是位于线粒体内膜上的质子载体蛋白，参与调控细胞内过氧化物质的生成, 能限制活性氧的产生，对心肌细胞有保护作用[9-10]，其基因多态性能影响活性氧的调节和抗氧化物质的含量[17]。已有研究显示其基因rs660339位点和rs659366位点的多态性与糖尿病、肥胖和心血管疾病等疾病的发病有关联[13-14, 18-19]。此外，既往研究表明UCP2基因rs660339位点多态性与胎儿神经管畸形相关[15]，表明UCP2基因多态性可能影响胎儿生长发育。但UCP2基因多态性影响CHD的具体机制有待进一步研究。
CHD的病因尚未完全阐明，目前认为是遗传和环境危险因素共同作用的结果。本研究结果显示，母亲糖尿病暴露和UCP2基因SNP在CHD发病中存在交互作用。胎儿心脏发育始于胚胎早期并在胚胎中期基本完成，胎儿在胚胎早期阶段对母体内环境最为敏感。糖尿病会导致胎儿生长的微环境处于高血糖状态，影响胎儿发育异常。此外，UCP2基因多态性可以调节活性氧含量，从而影响母亲机体内氧化应激水平[6-7]。当UCP2基因多态性和母亲糖尿病因素两者共同存在时，引起子宫内环境改变，导致子代CHD发生的风险增加。目前还没有关于UCP2基因SNP联合母亲糖尿病的交互作用的报道。本研究是国内首次探讨母亲糖尿病暴露和UCP2基因SNP的交互作用在子代CHD发病中的作用，有望为CHD的发病机制提供新的线索。今后将开展大型前瞻性队列研究证实本研究的发现。
本研究的局限性：第一，本研究是以医院为基础的病例对照研究，招募对象多为需要住院治疗的CHD患者，通过访谈回顾性收集相关暴露因素信息，因此，会不可避免存在选择偏倚和回忆偏倚。为了尽量减少偏倚，本研究在招募目标人群时，选择1岁以内儿童的母亲作为研究对象，并结合妇幼保健手册核实母亲糖尿病暴露信息。第二，由于样本量的限制，未评估母亲糖尿病、UCP2基因多态性与CHD亚型风险之间的关系，因此需要扩大样本量进一步研究。
综上所述，母亲糖尿病、UCP2基因多态性与子代CHD的发生有关，并且母亲糖尿病暴露和该基因在CHD发病中存在交互作用。这些发现为CHD的发病机制提供了新的线索，但这些因素具体影响CHD发病的机制尚不清楚，需要进一步开展大样本研究。
利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。
志谢: 本研究得到了湖南省儿童医院心胸外科的全力支持。该科室工作人员在繁忙的工作中承担了收集病例资料及收集标本的任务，同时为我们进行现场调查提供支持。在此，我们对该科室工作人员表示诚挚的感谢！
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