2020, Vol. 22
随着新生儿诊疗技术的进步，极早产儿的存活率大幅提高，然而部分早产儿仍会发展为支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia, BPD），其主要病理学特征是肺泡简单化、结构异常、肺血管发育异常，可导致呼吸道感染加重及终身肺功能下降，中-重度BPD预后差[1-2]。因此，阐明正常肺发育的生理机制对于研究肺发育疾病具有重要意义。
环状RNA（circular RNA, circRNA）是一类在真核生物中广泛存在的RNA分子，通常由前1个外显子的“首部”和后1个外显子的“尾部”发生反向剪接以共价键的方式形成封闭的共价环状结构[3]。近些年，circRNA的生物学功能逐渐被揭示，包括：（1）miRNA海绵：circRNA包含miRNA靶位点，竞争性结合miRNA，起到miRNA海绵的作用，从而解除miRNA对靶基因的抑制作用，增加靶基因的表达水平；（2）与RNA结合蛋白（RNA binding protein, RBP）结合；（3）被翻译成肽[4-5]。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，最近在植物、昆虫和哺乳动物中发现了丰富的circRNA[6-8]。本课题组前期研究中通过对Sprague-Dawley大鼠和C57BL/6J小鼠肺组织的circRNA表达谱进行差异筛选[9]，验证了多条circRNA在肺发育过程中存在差异表达，其中circ4:150439343|150477468和circ15:73330849|73343359是本课题组在C57BL/6J小鼠胎肺组织中发现并验证的差异表达倍数较大的两条circRNA（表 1）。然而目前有关这两条circRNA的具体作用仍不清晰。有鉴于此，本研究选择肺发育3个关键代表时间点，即孕16.5 d（E16.5 d）、孕18.5 d（E18.5 d）及生后2 d（P2 d）进行研究，其分别代表小鼠肺发育的小管期、囊泡期和肺泡期。应用qRT-PCR检测circ4:150439343|150477468和circ15:73330849|73343359在这3个时间点的相对表达量的变化趋势，并通过GO和KEGG进一步分析它们的生物学功能和信号通路，探讨这两条circRNA在小鼠肺发育中的作用及病理生理机制，以期为新生儿肺部相关疾病的诊断和治疗提供新的干预靶点。
| 表 1 circ4:150439343|150477468和circ15:73330849|73343359相关测序结果 |
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健康成年C57BL/6J小鼠36只（6~8周），由南京大学南京生物医学研究所提供，饲养于SPF级环境中。将雌鼠与雄鼠按照1 : 2比例合笼，次日上午检查时发现阴道栓记为雌鼠妊娠第0.5天。在E16.5 d、E18.5 d及P2 d，用4%水合氯醛麻醉（0.1 mL/10 g）孕鼠，快速取出胎鼠，采用颈椎脱臼法处死胎鼠及新生小鼠，快速取出肺组织。每组取1份左肺组织放入4%多聚甲醛中，其余肺组织经液氮速冻后储存在-80℃冰箱中。
1.2 苏木精-伊红染色向胎鼠及新生小鼠肺组织中加入4%多聚甲醛固定24 h。包埋在石蜡中，切片厚度为4 μm；二甲苯脱蜡3次；100%乙醇脱水3次，95%乙醇脱水3次，蒸馏水冲洗5 min；苏木素染色5 min，用流水稍冲洗5 min；1%盐酸乙醇分化30 s，自来水冲洗30 s，蒸馏水过水5 s；5%伊红染色3 min；80%乙醇-95%乙醇-无水乙醇彻底脱水；用二甲苯透明，最后中性树胶封盖，用Pannoramic MIDI扫描切片。
1.3 qRT-PCR法检测circ 4:150439343|150477468及circ15:73330849|73343359相对表达量用TRIzol提取肺组织总RNA，RNA质控合格后进行逆转录（Q232-02，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。按照PCR试剂盒（Low Rox Premixed，Q131-01，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）说明书步骤测定肺组织中circ4:150439343|150477468和circ15:73330849|73343359相对表达量。qRT-PCR反应体系（10 μL）：SYBR Green 5 μL，上下游引物各0.2 μL，DEPC水3.6 μL，cDNA 1 μL。qRT-PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 1 min，40个循环；最后72℃ 10 min。以GAPDH为内参，计算circRNA的相对表达量= 2-△△CT[10]。引物由锐博生物科技有限公司设计并合成（表 2）。
| 表 2 用于qRT-PCR的引物序列 |
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用miRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）和TargetScan（http://www.targetscan.org）软件预测差异表达的circRNA的靶向miRNA。用Gene Ontology（GO, http://www.geneontology.org/）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG, http://www.genome.jp/）分析亲本基因来预测circRNA功能。采用序列比对方法与circBase数据库中的环状序列进行比较，如果两者相似度超过90%，则认为两者是同1个circRNA[11]。
1.5 统计学分析使用SPSS 17.0统计软件和GraphPad Prism 6.0软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 小鼠肺发育光镜观察在E16.5 d，可见细支气管管腔被覆多层柱状上皮细胞，开始出现肺泡Ⅱ型及部分肺泡Ⅰ型上皮细胞；在E18.5 d，支气管管腔数量增加且明显扩张，间质变薄，肺泡Ⅱ型及部分肺泡Ⅰ型上皮细胞较前增多；在P2 d，肺泡上皮逐渐变薄，薄壁肺泡隔清晰可见，提示肺泡结构更加成熟。见图 1。
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图 1 肺发育过程中小鼠肺发育的形态学变化 E16.5 d：20倍镜下可见细支气管管腔（箭头所示），40倍镜下可见管腔被覆柱状上皮细胞（箭头所示）；E18.5 d：20倍镜下可见支气管管腔明显扩大，肺泡Ⅱ型上皮细胞明显增多（箭头所示），40倍镜下可见少许肺泡Ⅰ型上皮细胞（箭头所示）；P2 d：可见肺泡隔及次级间隔（箭头所示）。 |
在晚期肺发育的3个关键时期，即E16.5 d、E18.5 d和P2 d这3个时间点，circ4:150439343|150477468的相对表达量连续上调（P < 0.05）；circ15:73330849|73343359的相对表达量先下调再上调，P2 d的表达量明显高于其他两个时间点（P < 0.05）。见表 3。
| 表 3 qRT-PCR法检测小鼠肺发育过程中肺组织circ4: 150439343|150477468、circ15:73330849|73343359表达水平 |
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经过与circBase数据库进行比对，发现circ4: 150439343|150477468、circ15:73330849|73343359分别对应mmu_circ_0001213和mmu_circ_0005897。通过miRanda和TargetScan软件预测结果表明，circ4:150439343|150477468可能与miR-3102-5p.2-5p结合，circ15:73330849|7334335可能与miR-6769b-5p和miR-6989-3p结合。这两条circRNA从生物学过程而言，主要富集于通过质膜黏附分子黏附同质细胞、对信息素的反应、细胞间信号传导、细胞外基质组织等；从细胞成分而言，主要富集于蛋白质细胞外基质、细胞骨架、受体复合体、基底膜等；从分子功能而言，主要富集于信息素结合、信息素受体活性、细胞外基质结构成分、染色质结合等（图 2）。KEGG通路分析主要涉及Notch、PI3K-Akt、NF-κB、甲状腺激素、胰岛素、内分泌抵抗等信号通路（图 3）。
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图 2 与circ4:150439343|150477468、circ15:73330849|73343359相互作用的miRNA靶基因的GO功能富集分析图 橘色代表生物学过程，绿色代表细胞成分，蓝色代表分子功能。各绘制出排名前10的GO功能。 |
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图 3 与circ4:150439343|150477468、circ15:73330849|73343359相互作用的miRNA靶基因的KEEG富集分析图 横坐标代表miRNA靶基因注释在通路中的基因数，纵坐标代表通路。图中绘制出排名前20的信号通路。 |
随着产前激素和肺泡表面活性物质的应用，新生儿呼吸窘迫综合征患儿的存活率明显改善。但BPD在NICU中仍有较高的发病率和病死率，其病理生理学机制仍不明确，且缺乏有效的治疗方法[12]。因此继续探索正常肺部发育的分子机制，促进肺发育、修复和再生，或可发现治疗肺发育疾病的新靶标。circRNA是一类成环的非编码小RNA，具有miRNA海绵作用，即circRNA竞争性结合miRNA，解除miRNA对下游靶基因的抑制，增加靶基因的表达[3]。虽然已经报道了一些疾病模型的circRNA表达谱，但与小鼠肺发育相关的circRNA尚未报道。因此本课题组将着力于探索circRNA在小鼠肺发育过程中的具体作用。
本次研究发现在小鼠肺发育的3个代表性时间点（E16.5 d、E18.5 d、P2 d），circ4:150439343|150477468的相对表达量连续上调；circ15:73330849|73343359的相对表达量先下调再上调，P2 d时表达水平显著高于E16.5 d及E18.5 d时，这可能与小鼠生后肺发育已基本成熟有关。
我们预测circ4:150439343|150477468可能与miR-3102-5p.2-5p结合，circ15:73330849|73343359可能与miR-6769b-5p和miR-6989-3p结合。目前尚未有文献报道circ4:150439343|150477468和circ15:73330849|73343359的表达情况和功能。目前存有的报道表明miR-6769b-5p在白色念珠菌感染的巨噬细胞中明显下调，可能与炎症反应有关[13]。KEGG分析结果则显示，这两条circRNA主要涉及Notch、PI3K-Akt、NF-κB、甲状腺激素、胰岛素、内分泌抵抗等信号通路。而Notch、PI3K-Akt、NF-κB信号通路正与肺发育密切相关[14-15]。例如，Notch信号通路是高度保守的细胞间信号传导途径，它通过直接接触将信号传输至相邻细胞，适合短距离细胞通信。在器官发育和组织再生过程中，Notch信号通路在调节细胞增殖和分化中起重要的作用[16]。肺泡发育是由远端肺的内皮细胞、上皮细胞和间质基质协调发生的。Notch信号在血管和实质间隔的细胞分化中发挥关键作用，以协调肺泡和微血管系统的发育[17]。在肺发育过程中，肺血管中Notch基因的表达量逐渐升高，表明Notch信号通路在肺泡微脉管系统发育过程中发挥重要作用[18]。在胎肺中，Notch信号通路介导神经内分泌、纤毛细胞的分化及肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞的生成[19]。对Notch缺陷型小鼠进行生后存活分析表明，Notch2信号是肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖和成熟所必需的[20]。Tsao等[21]研究表明，肺泡上皮细胞上的Notch信号通过上皮-间质相互作用影响远端细支气管和肺泡的形态发生。因此，我们推测这两条circRNA很可能通过Notch信号通路参与肺泡上皮细胞及肺血管系统的形成及成熟，与肺发育密切相关，影响肺发育的机制还需后续进一步研究。
综上，本次研究发现这两条circRNA在肺发育的3个代表性时间点差异表达，且生物信息学结果亦表明可能与肺发育密切相关。但是circRNA研究尚处于起步阶段，这两条circRNA尚未有文献报道其相关功能，在后续研究中本课题组将探讨这两条circRNA对肺发育的调节作用及其机制，为有效治疗新生儿肺部疾病提供新思路。
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