2020, Vol. 22
2. 浙江省人民医院儿科, 浙江 杭州 310053
注意缺陷多动障碍（attention deficit hyperac-tivity disorder, ADHD）是儿童时期最普遍存在的精神行为障碍，其病因尚不明确[1]。ADHD儿童的核心症状主要有活动过度、注意力无法集中、行为冲动，这些症状极大地影响ADHD儿童的学业成绩、情绪行为及社会交往，严重影响其健康成长及成年后的家庭生活[2-4]。目前国际上通用的ADHD诊断标准是美国精神障碍与统计手册（第5版）（DSM-5）[5]。临床上主要依据DSM-5量表以问卷调查的形式对ADHD进行诊断和疗效评估，但这种方式较为繁琐，缺乏较为直观的分子生物学指标。
microRNA是调节基因转录的单链RNA分子，其作用主要是结合在靶分子mRNA的3′非翻译区（3′UTR），促进mRNA降解，抑制靶基因的转录[6-7]。microRNA在神经系统新陈代谢、神经发育、轴突形成、凋亡等病理生理过程中都有潜在的重要作用[8]。多项神经精神疾病领域研究表明，血液microRNA可以作为疾病诊断的新指标[9-10]。
本课题组先前的研究发现microRNA let-7d在ADHD儿童外周循环中表达升高[11]；ADHD模型自发性高血压大鼠（SHR）脑前额皮质中microRNA let-7d表达量升高[12]，miR-138-1、34c、296和494表达降低[13]，且人为改变microRNA let-7d的表达水平对SHR多动症状影响明显。因此我们猜测，ADHD儿童外周循环中可能存在一些microRNA表达异常，这些差异表达的microRNA有可能成为ADHD诊断及疗效评估的分子指标。随后本课题组收集了ADHD儿童与健康儿童血清样本进行高通量测序，结果显示，ADHD儿童外周血中miR-4655-3p和miR-7641表达显著降低[14]，猜想这两种microRNA有可能作为临床诊断ADHD的生物学指标之一。目前尚无关于miR-4655-3p和miR-7641在ADHD发病机制中作用的有关报道，本研究将比较药物治疗前后循环microRNA表达水平与临床症状的关系，以期为ADHD的诊断及疗效评估寻找新的分子生物学指标。
1 资料与方法 1.1 研究对象选取2017年5月至2018年10月就诊于浙江省人民医院儿科门诊，首次诊断为ADHD的儿童80例为研究对象。纳入及排除标准：（1）依据DSM-5诊断标准[5]，首次被诊断为ADHD的儿童；（2）经过系统的体格检查、神经系统检查、精神状况检查及相关实验室辅助检查；（3）6周岁及以上的儿童；（4）智商（intelligence quotient, IQ）大于70；（5）近2周内未使用精神药物及其他影响神经精神行为的药物治疗；（6）排除各种精神疾病，如精神发育迟缓、情绪品行障碍等；（7）排除躯体及神经系统等其他器质性疾病。依据治疗情况将80例ADHD儿童分为盐酸哌甲酯治疗组（n=31），其中男23例，女8例，年龄6~11岁，平均年龄8.3±1.8岁，平均体重29.8±4.6 kg，平均身高127±12 cm；盐酸托莫西汀治疗组（n=33），其中男24例，女9例，年龄7~12岁，平均年龄8.7±1.8岁，平均体重29.8±5.2 kg，平均身高129±8 cm；不愿接受治疗的儿童纳入未治疗组（n=16），其中男7例，女9例，年龄7~11岁，平均年龄8.1±1.2岁，平均体重28.3±6.2 kg，平均身高125±10 cm。另选取行健康体检儿童60例为健康对照组，年龄6~12岁，平均年龄8.4±1.7岁，平均体重27.0±4.3 kg，平均身高126±10 cm。4组儿童性别、年龄、身高及体重比较差异均无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究获得了浙江省人民医院医学伦理委员会批准，及通过监护人同意并签署书面知情同意书。
1.2 评分量表（1）韦氏智力评分表[15]：测试内容包括语言和操作两大类，测试时间1~2 h。（2）Conners父母评定量表[16]：总分大于10分即需要进一步进行SNAP-V量表评分。（3）SNAP-V量表父母版[17]，使用4级评分法评估注意力不集中和多动/冲动两个方面症状。最后把每个问题的得分相加，再除以所有问题总数给予得分。0~1.0分为正常；1.1~1.5为边缘；1.6~2.0分为中度；2.0分以上为严重。
1.3 总RNA抽提及荧光定量PCR检测将ADHD儿童首诊及随访3个月、6个月时，以及健康对照组儿童门诊当天采集的空腹静脉血血清标本用TRIzol试剂（北京天根生化科技有限公司）在室温下处理5 min，然后根据试剂盒说明书提取总RNA。使用特异性逆转录引物从血清总RNA中通过逆转录酶（日本TaKaRa公司）获得cDNA。采用荧光定量PCR对miR-4655-3p和miR-7641进行扩增。根据本课题组前期研究结果显示[14]，miR-1273g-3p在所有样本内均有检出、标准差较小且平均信号值较高，因此选择miR-1273g-3p作为内参进行校正。采用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成，序列见表 1。反应体系（10 μL）：SYBR Green qPCR Master Mix（2×）（上海星汉生物科技有限公司）5 μL、上下游引物（40 μmol/L）各0.2 μL、cDNA 1 μL、双蒸馏水3.6 μL。反应条件：94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 10 min。通过iQ5TM定量PCR检测系统（美国Bio-Rad公司）进行PCR反应，并用iQ5软件分析结果。最后采用2-ΔΔCt法计算基因表达相对定量结果。
| 表 1 引物信息 |
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对ADHD儿童进行为期12周的药物治疗：（1）盐酸哌甲酯片（苏州第壹制药有限公司，批号：H32023102），初始剂量为每日0.3 mg/kg，每周增加0.3 mg/kg，目标剂量为每日1.2 mg/kg，可根据实际临床反应增减目标剂量，如是否有明显的副作用或是否有进一步改善的空间，最大剂量可增加至每日1.8 mg/kg。在第7~10周维持最佳剂量。（2）盐酸托莫西汀胶囊（江苏正大丰海制药有限公司，批号：H20133346），初始剂量为每日0.5 mg/kg，维持3 d后增加给药量至目标剂量为每日1.2 mg/kg，在第7~10周维持最佳剂量。药物依从性：64例愿意接受ADHD药物治疗的儿童中共脱落23例，其中盐酸哌甲酯组10例，盐酸托莫西汀组13例。失访原因主要有：由于副作用大而停止治疗10例，家长认为药物疗效欠佳停止治疗6例，家长认为孩子已经痊愈而不必继续治疗4例，家长担心药物副作用不愿意继续服用2例，因家庭经济原因停止治疗1例。
1.5 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计学分析。正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验；多时间点重复测量数据比较采用重复测量方差分析。采用GraphPad Prism 8软件进行两数值变量间Pearson相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组ADHD儿童间首诊和随访时SNAP-V评分变化ADHD儿童首诊、随访3个月及6个月测量的注意力不足及多动冲动症状SNAP-V评分比较差异有统计学意义（P < 0.05）。注意力不足症状SNAP-V评分在各组间比较差异有统计学意义（P < 0.05），多动冲动症状SNAP-V评分在各组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。注意力不足症状SNAP-V评分时间因素与分组因素有交互作用（P < 0.05），多动冲动症状SNAP-V评分时间因素与分组因素无交互作用（P > 0.05）。见表 2。
| 表 2 各组ADHD儿童间首诊和随访SNAP-V评分比较（x±s） |
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治疗前，ADHD儿童miR-4566-5p的相对表达量（0.46±0.31）明显低于健康对照组（2.18±0.85）（t=14.352，P < 0.01）；ADHD儿童miR-7641的相对表达量（0.29±0.22）亦明显低于健康对照组（1.80±0.42）（t=23.789，P < 0.01）。
2.3 药物治疗后两种microRNA相对表达量在各组的变化ADHD儿童首诊、随访3个月及6个月测量的miR-4655-3p和miR-7641相对表达量差异均有统计学意义（P < 0.05）。miR-4655-3p和miR-7641相对表达量在各组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。分组与时间两因素在miR-4655-3p和miR-7641相对表达量中均存在交互作用（P < 0.05）。见表 3。
| 表 3 各组儿童miR-4655-3p和miR-7641的相对表达量比较 |
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两治疗组ADHD儿童（n=41）注意力不足症状SNAP-V评分与miRNA-4655-3p和miRNA-7641的相对表达量均呈显著负相关（分别r=-0.314、-0.495，P < 0.05）。见图 1。
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图 1 注意力不足症状SNAP-V评分与miR-4655-3p（左）和miR-7641（右）相对表达量的相关性分析图 |
ADHD为研究最多的儿童期疾病之一，在临床治疗上常用的药物主要有盐酸哌甲酯、盐酸托莫西汀等，主要通过调节中枢儿茶酚胺类神经递质多巴胺（DA）和去甲肾上腺素（NA）代谢发挥作用。其中哌甲酯及其控释剂为临床一线治疗药物，大量文献报道其疗效显著。非兴奋剂盐酸托莫西汀为选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂，无药物成瘾性，耐受性好，适合长程使用[18-19]。本研究最终完成为期6个月治疗的41例ADHD儿童治疗结果显示，药物治疗可显著改善ADHD儿童的多动冲动症状。
ADHD其病因目前尚不明确，有研究支持环境因素在ADHD发病中起到重要作用，即表观遗传调控过程。其中一类短链非编码RNA，即microRNA，是这些表观遗传的调节剂之一，被称为转录后调节剂，microRNAs影响大约30%的人类蛋白质编码基因的表达[20-21]。本课题组前期收集的ADHD儿童血清样本二代测序结果显示，miR-4655-3p和miR-7641在ADHD儿童血清中表达显著降低[14]，然而并没有对这两种microRNA与药物治疗及临床症状之间的关系进行深入研究。本研究对此次纳入的ADHD儿童采集药物治疗前、治疗3个月及6个月时的血清样本，以及同年龄的健康体检儿童的血清样本，结果显示与健康对照组进行比较，两种microRNA在ADHD儿童中均降低。在接受治疗后，miR-4655-3p和miR-7641的相对表达量均逐渐恢复到正常水平。由此我们可以初步确定，miR-4655-3p和miR-7641在ADHD儿童外周血清中较健康儿童显著降低，随着病情的好转逐渐升高。
ADHD的主要发病机制是中枢儿茶酚胺类神经递质DA和NA代谢障碍造成的轻度脑功能缺陷。本课题组在2010年首次报道了microRNA let-7d在ADHD大鼠模型中的作用，结果显示microRNA let-7d的异常表达可以影响大鼠的多动症状[12]。随后有研究证明血清microRNA let-7d的水平在ADHD组明显高于正常对照组；microRNA let-7d直接作用于LGALS3的3′UTR，从而负性调控LGALS3的表达，而LGALS3的降低能抑制TH的表达，TH是多巴胺合成过程中的限速酶[22]，在ADHD发病中起着重要作用。此外，Jiang等[23]发现血清分泌的含miR-137的外泌体通过调节帕金森病中的OXR1来影响神经元的氧化应激。另有研究者发现血浆microRNA可作为早期诊断锰中毒性帕金森综合征生物标志物[24]。这些研究结果均显示，在疾病的发生发展过程中，循环microRNA的表达水平与疾病的临床表现有着紧密的联系。对ADHD儿童临床症状SNAP-V评分与miR-4655-3p及miR-7641的相对表达量进行相关性分析，我们发现注意力不足症状SNAP-V评分与两种microRNA的相对表达量均呈显著负相关。说明miR-4655-3p和miR-7641的表达水平可能通过直接或间接的方式影响ADHD儿童的临床症状，结合microRNA的经典作用途径及药物治疗ADHD的主要作用机制，确定miR-4655-3p和miR-7641的靶向基因及该靶基因在ADHD发病过程中的作用机制还有待后续实验深入研究。
综上所述，miR-4655-3p和miR-7641参与了ADHD的发生发展过程，且经药物治疗后ADHD血清中两种microRNA与临床症状有着相似的转归过程，miR-4655-3p和miR-7641可能作为ADHD诊断及疗效评估的分子标记物。
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